山羊β防御素124定位及過表達附睪頭上皮細胞系的建立

黃鑫蕓，張俊梅，邰苗苗，2，孟繁榮，任有蛇，張春香，2

（1.山西農業大學 動物科學學院，山西 太谷 030801；2.河南省農墾發展服務中心，河南 鄭州 450003）

β防御素是動物機體內一類重要的內源性且具有先天免疫作用的抗菌肽。在雄性動物生殖器官中表達的β防御素種類最多，且具有明顯的物種差異[1-6]。人[1]、鼠[2]、豬[4]、綿羊[5]和山羊[6]生殖器官中分別表達有38、35、29、34、32種防御素，它們不僅發揮抗菌作用[7]，同時也在精子成熟過程中發揮重要作用[8-9]。β防御素124（BD124）是羊附睪頭中表達量最高的β防御素[5-6]，附睪頭BD124是山羊23種組織中表達量最高的β防御素[10]，對于揭示其生物學功能具有重要意義。2015年，張春香等[11]用生物信息學方法預測出山羊附睪頭BD124有4個磷酸化位點，可能具有生物調節作用。基因過表達和敲減等方法是研究蛋白質功能的主要方法[12-13]。2014年，KIM等[14]將商業化BD124過表達質粒載體BD124-DDK-Myc轉染到前列腺上皮RWPE-1細胞中，結果發現，BD124過表達增加了細胞因子白細胞介素6（IL-6）和12（IL-12）的表達。2020年，孟繁榮等[15]用BD124敲減的RNAi慢病毒載體轉染山羊附睪頭細胞，發現BD124通過調控p38MAPK/AP1通路影響先天性免疫。目前，尚未見有山羊BD124過表達載體構建的報道。

本研究首先對附睪頭上皮細胞進行BD124定位，并進一步進行BD124過表達載體及過表達附睪頭上皮細胞系構建，旨在深入研究其生物學功能，為BD124抗菌肽產品開發提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試太行山羊附睪頭上皮細胞系和pEX1-EGFP-BD124質粒由山西農業大學動物科學學院動物繁殖實驗室提供，鼠源BD124單克隆抗體和兔源多克隆抗體由山西農業大學動物科學學院羊繁殖生理研究課題組制備。DAPI、FITC-羊抗鼠IgG、無菌PBS購自博士德生物工程有限公司，NotⅠ和BamHⅠ內切酶購自Takara生物工程公司，DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

主要儀器設備有TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡儀器有限公司），Odyssey?CLX雙色近紅外成像系統（美國LI-COR Biosciences）。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊BD124蛋白定位方法 用1%多聚賴氨酸包被直徑為12 mm的細胞爬片，將包被后的細胞爬片放入24孔細胞培養板內培養，隨后用太行山羊附睪頭上皮細胞鋪板，待細胞生長1 d后，取出細胞爬片，用PBS沖洗3次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定30～40 min后用PBS洗滌，用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液煮沸5 min，室溫冷卻后用PBS洗滌，37℃恒溫條件下用山羊血清封閉1 h后甩掉封閉液，在樣品孔滴加BD124單克隆抗體（1∶100）稀釋液后4℃孵育過夜。設置PBS孵育組為對照，第2天取出孵育組細胞爬片后在37℃復溫1 h，再用PBS洗滌，滴加FITC-IgG二抗（1∶100）后用錫箔紙包裹，37℃恒溫箱孵育30 min，PBS洗滌后滴加40 μL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），錫箔紙包裹后37℃孵育10 min，PBS洗滌，最后用抗熒光衰減劑封片，用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.2BD124過表達載體構建 以pEX1-EGFPBD124質粒為模板，用添加LV5的EF-aF//綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）和嘌呤霉素（Puromycin，Puro）載體NotⅠ和BamHⅠ酶雙側同源序列的引物序列（表1）擴增山羊BD124的全長序列。擴增體系組成（50 μL）：10×Buffer（＋Mg2＋）5.0 μL、上下游引物和dNTP各1.0 μL、模板1.0 μL、DNA聚合酶0.3 μL、ddH2O 40.7 μL；PCR反應產物經瓊脂糖電泳后切膠回收備用。用內切酶BamHⅠ和NotⅠ酶將穿梭質粒LV5載體線性化。酶切體系組成（25 μL）：BamHⅠ和NotⅠ酶各0.5 μL、LV5質粒模板7.0 μL、10×Buffer 3.0 μL和ddH2O 14.0 μL，37℃孵育2 h后回收線性化LV5載體。按重組克隆試劑盒說明書將BD124克隆到LV5載體上，然后將連接產物轉化感受態細胞，37℃培養16 h。挑取陽性克隆后搖菌并保存菌液。抽取20.0 μL菌液送北京華大基因公司測序，確認測序結果與山羊BD124質粒序列一致后，用陽性克隆菌液搖菌后進行質粒提取備用，即為LV5-BD124重組穿梭質粒，將BamHⅠ和NotⅠ雙酶切質粒采用瓊脂糖電泳鑒定。

1.2.3 LV5-BD124過表達載體慢病毒包裝 在6 cm培養皿中培養293T細胞，在融合度達80%～90%時，用胰酶消化離心收集后細胞，加入2 mL含DMEM的完全培養基，輕輕吹打為單細胞懸液。將該懸液接種到10 cm的培養皿中，加入12 mL完全培養基后在37℃、5%濃度的CO2環境下培養過夜。將4.5 μg重組穿梭質粒LV5-BD124、4.5 μg包裝質粒（pRev+pMDL+pVSV-G，比例為2∶5∶3）和20.0 μL Fugene HD轉染試劑與1.2 mL無血清DMEM混勻，室溫放置30 min，滴加到239T細胞后加入5 mL無血清DMEM，37℃、5%CO2下孵育6 h，吸出棄上清后用12 mL完全培養基繼續培養72 h，收集上清，過濾后4℃下20 000 r/min超速離心2 h，分裝后在-80℃保存備用。用有限稀釋法進行病毒滴度檢測。

1.2.4 LV5-BD124慢病毒載體侵染條件優化 將對數生長期山羊附睪頭上皮細胞鋪到96孔板中用于篩選最佳病毒侵染濃度和最佳侵染體系，侵染體系分為添加0、5.0 μg/mL Polybrene（聚凝胺）2組，慢病毒添加設定MOI值（侵染病毒數目與細胞數量的比值）為1、10、100等3個。當細胞融合率達40%時，用包裝好LV5-BD124慢病毒進行侵染，每組3個重復，24 h后換成完全培養基，72 h后拍照觀察熒光信號強度。

1.2.5 重組LV5-BD124病毒載體過表達效果分析 選擇最佳慢病毒載體濃度用于后續試驗。采用24孔板，設置LV5-BD124過表達組（LV5-BD124）、LV5空載體組（LV5-NC）和對照組（Blank），侵染后96 h收集細胞用于提取mRNA并進行BD124熒光定量分析（引物如表1所示）。120 h后收集細胞用于提取蛋白，Western blot檢測BD124蛋白過表達情況，一抗孵育濃度1∶2 000，熒光二抗孵育濃度1∶20 000，獲取圖像后用Image Studio軟件分析灰度值。

表1 PCR所用引物Tab.1 Primes for PCR

1.2.6 重組LV5-BD124過表達上皮細胞穩轉系建立 重組LV5-BD124過表達載體侵染附睪上皮細胞72 h后吸出培養基，用PBS沖洗。參考邰苗苗等[16]的方法更換為含有嘌呤霉素2.0 μg/mL不含青鏈霉素雙抗的完全培養基進行陽性細胞篩選，胰酶消化72 h后，收集細胞，轉至培養瓶中繼續培養，48 h后進行第2次篩選，直至細胞融合度達80%～90%時進行傳代培養。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0中的ANOVA程序分析熒光定量和蛋白灰度值，用Duncan法多重比較后采用GraphPad Prism 5作圖。

2 結果與分析

2.1 附睪頭上皮細胞BD124蛋白定位

采用共聚焦激光顯微技術用單克隆抗體對附睪頭上皮細胞BD124蛋白進行免疫熒光定位，結果如圖1所示，山羊BD124蛋白在細胞核周圍高度聚集，在細胞質和細胞核內均有分布；而對照組無熒光信號，結果可靠。

圖1 山羊附睪頭上皮細胞BD124的免疫定位Fig.1 Immunolocalization of BD124 in the epididymal caput epithelial cells of goats

2.2 BD124過表達載體構建與鑒定

2.2.1 LV5-BD124過表達慢病毒載體構建LV5-BD124過表達載體經BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后的瓊脂糖電泳結果如圖2所示，在200 bp和8.0 kb附近可見2條清晰條帶，與山羊BD124 CDS區片段長度207 bp相符，與LV5載體9.3 kb的片段長度基本相符。

圖2 LV5-BD124載體雙酶切膠Fig.2 Double enzyme digestion of LV5-BD124 vector

菌液測序結果如圖3所示，經比對，測序結果與NCBI中山羊BD124的CDS區序列（KC763800.1）完全一致。說明BD124已成功克隆到LV5穿梭質粒載體中。用LV5-BD124穿梭質粒與包裝質粒分別轉染293T細胞后，收集病毒，采用有限稀釋法測定LV5-BD124慢病毒載體的病毒滴度為3.0×108TU/mL。

圖3 LV5-BD124載體雙酶切測序結果Fig.3 Sequencing map of double enzyme digestion of LV5-BD124 vector

2.2.2 LV5-BD124慢病毒載體侵染條件優化 山羊附睪頭上皮細胞在LV5-BD124慢病毒載體侵染72 h后熒光表達情況如圖4所示，添加5 μg/mL Polybrene的侵染體系可極大提高侵染效率，且當MOI值為100時，本體系中具有熒光的陽性細胞數超過80%。后續試驗均采用本侵染體系和MOI值。

圖4 LV5-BD124慢病毒載體侵染72 h熒光情況Fig.4 The fluorescence intensity after 72 h of LV5-BD124 lentivirus vector infection

2.2.3 重組LV5-BD124過表達效果分析 熒光定量PCR結果和Western blot蛋白定量結果如圖5所示。圖5-A結果顯示，LV5-BD124轉 染96 h后山羊附睪頭上皮細胞BD124 mRNA表達量顯著升高（P＜0.05）；圖5-B中Western blot結 果 顯 示，LV5-BD124慢 病 毒 載體侵 染120 h后，BD124蛋 白條帶比空白對照和空載體對照組的蛋白條帶更深更粗；圖5-C灰度值分析顯示，LV5-BD124慢病毒侵染后，BD124蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），說明經重組LV5-BD124慢病毒載體侵染后BD124蛋白在山羊附睪頭上皮細胞中過表達。

圖5 LV5-BD124侵染后BD124 mRNA和蛋白的表達Fig.5 Expression of BD124 mRNA and protein after LV5-BD124 infection

2.3 BD124過表達附睪頭上皮細穩轉系的建立

BD124過表達附睪頭上皮細胞系的建立過程如圖6所示，重組LV5-BD124載體侵染附睪上皮細胞24 h后，從綠色熒光表達情況可以看出，BD124首先圍繞細胞核形成熒光圈，但細胞核區內和細胞質中也有表達，支持BD124蛋白定位結果；侵染72 h后細胞融合度達80%，熒光強度增加，經2 μg/mL嘌呤霉素2次篩選后，陽性細胞密度高而且熒光強度增加。第2次傳代培養后120 h，陽性細胞形態和熒光強度正常，可以正常傳代。

圖6 BD124過表達附睪頭上皮細胞穩轉系建立Fig.6 Construction of BD124 overexpressed stable cell strain of epididymal caput epithelial cells

3 結論與討論

BD124在山羊附睪頭細胞中高表達，附睪頭是精子成熟的主要場所，高表達BD124蛋白在附睪頭發揮的生物學功能應進行深入研究。據研究報道，蛋白質亞細胞定位與生物學功能的預測有密切關系[17-18]。張春香等[11]用生物信息學方法進行BD124亞細胞定位預測發現，該蛋白可能在線粒體中表達，但用生物信息學軟件進行蛋白質亞細胞定位是根據提供的BD124氨基酸序列使用特定算法進行預測，只能作為一個參考。

本研究中，采用BD124單克隆抗體細胞免疫熒光定位發現，BD124在附睪頭上皮細胞核和細胞質中均可以表達，另外用LV5-BD124慢病毒載體侵染細胞后，最初在細胞核膜周圍形成一個BD124蛋白環，隨著時間延長蔓延至整個細胞。上述結果與KIM等[14]用BD124過表達質粒載體轉染前列腺上皮RWPE-1細胞后BD124蛋白分布結果一致，說明BD124除具有防御素本身的抗菌作用外，還具有其他生物學功能。孟繁榮等[15]研究結果也證實，BD124敲減后可引起附睪頭細胞細胞因子基因和蛋白表達的變化。但BD124與何種配體相互作用激活下游信號通路，仍需進一步深入研究。

BD124蛋白定位雖可預測該蛋白的功能，但運用基因過表達或敲除技術構建基因過表達或敲除體外細胞模型或動物模型則是研究其生物學功能的主要方法[19-21]。常用的構建過表達載體的方法有2種：質粒載體法和病毒載體法。其中，質粒載體法在實驗中使用較多[22-24]，較為簡單，但缺點是在有些細胞中轉染效率比較低，且附睪頭細胞是質粒載體難轉染的細胞。前期試驗中已構建了過表達pEX1-EGFP-BD124質粒載體，嘗試了不同的脂質體、細胞比例、轉染時間和多種轉染試劑，但轉染效率始終非常低。參考KIM等[14]將商業化的過表達載體質粒轉染到前列腺上皮RWPE-1細胞系中的成功案例，本試驗將pEX1-EGFP-BD124轉染到293T細胞中，熒光表達效果較好，說明質粒載體構建成功。

慢病毒是一類能高效整合并長期穩定表達長片段外源性目的基因，生物安全性高且可操控性強的重組反轉錄病毒載體，可高效侵染神經元細胞、心肌細胞、內皮細胞等多種類型細胞，成為理想的基因轉移載體，同時也是現代體內基因治療首選載體[25-28]。用Polyfect-V脂質體介導慢病毒空載體侵染山羊附睪上皮細胞后發現轉染效率較高，說明慢病毒載體能成功轉入附睪頭上皮細胞。因此，本試驗選擇了攜帶2個標記基因GFP和Puro的LV5載體。GFP表達一方面可用于對包裝病毒進行滴度測定，也可用于檢測陽性細胞數量和檢測轉染效率。Puro基因在陽性細胞中表達，未侵染成功的細胞則被嘌呤霉素殺死[16]，大部分試驗采用單次篩選法[27-28]。本試驗采用嘌呤霉素進行2次篩選提高以BD124過表達的陽性細胞純度，傳代等過程處理后過表達附睪頭上皮陽性細胞的過表達能力仍然很好保持，說明成功構建了BD124過表達附睪頭上皮細胞系。BD124過表達將引發的細胞信號通路變化有待深入探究，同時也需進一步分析比較BD124敲減后與過表達后通路的變化，以期為將來科學開發利用BD124奠定理論基礎。