國家東南區鮮食糯玉米品質及農藝性狀與SSR標記遺傳多樣性分析

仇律雯， 楊 揚， 范亞明， 田紅麗， 易紅梅， 王 璐， 任 潔， 葛建镕， 王鳳格， 陸大雷

(1.江蘇省作物遺傳生理重點實驗室/江蘇省作物栽培生理重點實驗室/江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心/揚州大學農學院，江蘇揚州 225009； 2.北京市農林科學院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，北京100097)

糯玉米別稱黏玉米、蠟質玉米，籽粒中支鏈淀粉含量接近100%，可在乳熟期收獲果穗用于鮮食，具有很高的營養價值和經濟價值，其相關產業發展潛力巨大，是近年來我國種植業結構調整、貫徹落實鄉村振興戰略、拉動地方經濟增長的首選作物。我國作為世界上糯玉米種植面積最大的國家，對糯玉米的規劃和發展尤為重視，主要表現在以下方面：2000年，糯玉米作為鮮食玉米納入國家品種管理，其選育品種開始參加國家級鮮食玉米區域試驗；2008年，全國農業技術推廣服務中心品種管理處對鮮食玉米品種區域試驗進行了改革完善，將我國糯玉米種植區域劃分為東南、西南、東華北、黃淮海4個大區。東南區由于氣候適宜、經濟較為發達、當地居民喜食糯玉米等原因一直是參試品種數量最多的區域。隨著人們生活水平的提高和膳食結構的變化，人們對于鮮食糯玉米營養、口感的要求也在不斷提高，使得選育和推廣產量合格、品質達標的鮮食糯玉米新品種成為東南地區糯玉米產業健康發展的關鍵。區域試驗是新品種選育和推廣的重要環節，參試品種代表了糯玉米的育種動向和選育水平，應用分子標記、形態學標記分析東南地區鮮食糯玉米參試材料的遺傳多樣性，探索不同遺傳背景下糯玉米農藝、品質性狀差異對于該地區鮮食糯玉米產業的可持續發展具有重要意義。

農藝性狀、品質性狀是形態學標記的重要組成部分，其中農藝性狀是玉米區域試驗中衡量參試樣品是否能在相應區域種植的主要指標；由于鮮食特用玉米的需求，糯玉米的籽粒品質在品種評價中同樣占有舉足輕重的地位。目前常用的分子標記有簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)標記和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)標記，其中SSR標記靈敏度高、重復性強，能夠在品種間穩定遺傳，已經被廣泛應用于玉米、水稻、小麥等作物的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建。基于SSR標記對供試材料進行聚類分析，同時結合具有代表性的優良品種能夠準確劃分組群，了解樣品的遺傳背景，反映樣品間的遺傳差異。糯玉米屬于異花授粉作物，是雜種優勢利用的典型，其雜交種的遺傳背景主要取決于雜優模式中親本的遺傳組成。雜優模式不同使得親本間的遺傳差異較大，使得選育出的品種表現出不同的遺傳背景。胡俏強等利用玉米50 K芯片將90份鮮食玉米資源劃分為4個不同遺傳背景的類群，并依此分析了溫-熱帶雜優模式的農藝、品質和抗性特點，為鮮食玉米品種選育提供了新方向。在雜交種方面，韓晴等基于SSR標記將50個糯玉米品種劃分為3個主要類群，并分析了每個類群的品質、農藝性狀的變異程度，為糯玉米新品種的改良提供了基礎。目前針對糯玉米品質及農藝性狀與SSR標記的遺傳多樣性分析多以某一省份為分析單元，同時對多個省份糯玉米材料進行多樣性研究的報道甚少，對東南區鮮食糯玉米參試品種的雜優模式和相關農藝、品質性狀的研究尚未見報道。

本研究以2018年、2019年國家東南區糯玉米參試品種為材料，通過形態學標記、分子標記探究東南區糯玉米品種在不同遺傳背景下品質、農藝性狀的差異，以期為今后全面了解東南區糯玉米不同雜優模式所育成品種的農藝、品質性狀特點提供參考，對相應地區糯玉米新品種改良及資源高效利用具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的41份材料為2018年、2019年參加國家東南區鮮食玉米區域試驗的糯玉米區試品種，其中形態學標記對照為蘇玉糯5號，分子標記定標品種為當前具有廣泛代表性的對照品種或大面積推廣的品種，分別為蘇玉糯5號、京科糯2000、渝糯7號和鄭黃糯2號。

1.2 農藝與品質性狀及其測定

農藝性狀包括株高、穗長、穗行數、千粒鮮質量、出籽率、產量等6個參數，相關數據均來自國家東南區鮮食玉米區域試驗江蘇省農業科學院糧食作物研究所試驗點區試報告。

品質性狀包括籽粒淀粉含量、直鏈淀粉含量、皮渣率、含水率、蛋白質含量和淀粉糊化溫度。其中淀粉含量按照GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉測定法》用蒽酮比色法測定，直鏈淀粉含量參照GB 7648—1987《水稻、玉米、谷子籽粒直鏈淀粉測定法》測定。皮渣率參考農業農村部試行方法進行測定。含水率=(百粒鮮質量-百粒干質量)/百粒鮮質量×100%。利用凱氏定氮法測定籽粒氮含量(蛋白質含量=氮含量×6.25)。糊化溫度相關測定方法見文獻[18]。

1.3 SSR標記的選擇及其試驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取 采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取供試材料的基因組DNA，用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)紫外分光光度計測定DNA的質量和濃度，并根據測量值將工作液濃度調至200 ng/μL。

1.3.2 SSR標記的選擇 本研究選用的40個SSR標記為中國玉米審定品種標準DNA指紋庫建庫標記，引物名稱、參數等具體信息見文獻[19]。

1.3.3 PCR擴增及熒光毛細管電泳 PCR擴增反應體系為20 μL，其中包括2 μL DNA模板、0.25 μL引物、10 μL 2×Plus Master Mix和7.75 μL ddHO。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min，擴增產物于4 ℃保存。

采用10重PCR產物電泳檢測的方法，將10對PCR產物混合后取2 μL于96孔電泳板中，加入 10 μL 去離子甲酰胺、0.2 μL GS3730-500分子量內標，置于PCR儀器中于95 ℃變性5 min，將變性后所得產物離心(2 000 r/min，30 s)后置于ABI3730XL DNA分析儀上進行熒光毛細管電泳，預電泳時間為2 min，電壓為15 kV，電泳時間為 20 min，電壓為15 kV。

1.4 數據分析

用Excel 2016統計分析12個農藝及品質性狀數據的最大值、最小值、平均值、變異系數和Simpson多樣性指數。Simpson多樣性指數計算公式見文獻[20]。在SPSS 25中采用非參數檢驗對聚類各組農藝及品質性狀進行差異性分析。用ABI3730XL DNA分析儀上自帶的Date Collection V1.0軟件收集電泳后的原始數據并形成FSA文件，用SSR Analyser V1.2.4指紋分析器對FSA文件進行基因分型分析。使用PowerMarker V3.25軟件統計41份糯玉米材料的等位變異數、基因型數、雜合度和多態信息含量(polymorphism information content，PIC)等信息，同時計算材料間的Rogers 1972遺傳距離，得到非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚類結果，并用EvolView V 2.0軟件對聚類結果進行修飾，得到UPGMA系統發生樹形圖。

2 結果與分析

2.1 供試材料的遺傳多樣性分析

2.1.1 品質及農藝性狀多樣性分析 對41份糯玉米材料的12個農藝及品質性狀進行統計分析。由表1可知，不同糯玉米材料的形態學標記存在差異，12個性狀的變異系數在1.72%～36.10%間變化，平均值為14.06%。6個農藝性狀中千粒鮮質量的變異系數最大，為12.01%；出籽率的變異系數最低，為5.28%。6個籽粒品質性狀中直鏈淀粉的變異系數最高，為36.10%；糊化溫度的變異系數最低，為1.72%。12個性狀的Simpson指數在0.69～0.83之間，平均值為0.78，其中含水率和產量的Simpson指數最高，為0.83。由描述性統計結果可以看出，41份供試材料的表型性狀多樣性較高。

表1 41份糯玉米材料的農藝、品質性狀描述

2.1.2 SSR標記基因多樣性和多態性分析 41份糯玉米材料在40個SSR標記上共檢測出321個等位基因，平均每個SSR標記檢測出8.025個等位基因。由表2可以看出，40個SSR標記的基因多樣性在0.186～0.877之間，平均值為0.687；PIC值在0.179～0.866之間，平均值為0.658。引物P18擴增產物的基因多樣性和PIC值均最低，引物P40擴增產物的基因多樣性、PIC值均最高。在40個SSR標記中，PIC值>0.5的高多態性標記達36個，占全部標記數的90%，表明本研究所選標記能夠有效反映供試材料的遺傳多樣性信息。

表2 40個SSR標記的多態性信息

2.2 參試材料的遺傳背景分析

由圖1可知，基于Rogers1972遺傳距離矩陣將45份供試材料分為4個大組，在系統發生樹上用不同顏色的線條標志4個聚類分組，以京科糯2000為代表的第Ⅰ組材料數量最多，共有20份，占供試材料總數的44.4%；第Ⅱ組以蘇玉糯5號為代表，共有12份材料；以鄭黃糯2號為代表的第Ⅲ組材料數量最少，只有6份；有7份材料被分在第Ⅳ組，組內代表品種為彩甜糯6號。

2.3 不同遺傳背景下糯玉米的農藝及品質性狀分析

分析各個聚類分組的形態學標記特點可知，在產量性狀方面，聚類Ⅰ組的產量、千粒鮮質量分別為14 354.19 kg/hm、433.39 g，其均值高于另外3個組別。在籽粒品質方面，4個聚類分組的含水率均值為59.56%～63.79%，直鏈淀粉含量的均值為2.28%～3.04%，皮渣率的均值變化幅度較小，其中聚類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的皮渣率均在10%左右。為了探究不同遺傳背景下糯玉米材料在農藝、 品質性狀上是否存在顯著差異，對聚類各組的形態學指標進行非參數檢驗。表3結果表明，12個農藝、品質性狀中有3項指標在組間存在顯著差異，分別為株高、千粒鮮質量和含水率。聚類Ⅰ組的千粒鮮質量、含水率高于其他組，株高較低；聚類Ⅱ組的含水率、株高較低，千粒鮮質量較高；聚類Ⅲ組的千粒鮮質量低于其他組，含水率、株高表現為平均水平；聚類Ⅳ組的株高較高，含水率在4個組中較為居中，千粒鮮質量較低。將組間存在顯著性差異的3項指標數據標準化后標注在系統發生樹末端，以圓形面積代表指標的數值，面積越大表示數值越高，詳見圖1，并觀察面積差異最大的2組，發現各項指標的標注結果與非參數檢驗結果一致。

表3 4個聚類分組的農藝、品質性狀非參數秩和檢驗結果

3 討論與結論

遺傳多樣性作為生物多樣性的最重要來源，是物種多樣性的基礎。形態學標記、分子標記是研究物種遺傳多樣性的2個主要標記，利用形態學標記來檢測作物的表型變異簡單易行，可以直觀地展示品種特點。與形態學標記相比，分子標記排除了環境和人為因素影響，同時在品種間穩定遺傳，能夠準確反映樣品間的遺傳差異。本研究利用形態學標記和分子標記研究國家東南區鮮食糯玉米區試材料的遺傳多樣性特點，發現其有豐富的農藝、品質性狀變異和SSR標記基因多樣性。與陸大雷等于2002—2014年關于東南區參試材料的研究結果相比，本研究所選材料在產量、出籽率和千粒鮮質量3個指標上有所提升。與王鳳格等在2004—2009年進行的鮮食玉米區試結果相比，本研究所選材料的等位基因數目、PIC值均有所提高。由此可見，隨著育種技術的發展和雜優模式的創新，糯玉米的部分農藝指標在逐漸提優，在分子層面上也表現出越來越豐富的遺傳變異。與楊揚等在2012—2019年進行的東南區糯玉米審定試驗結果相比，本研究所選區試材料的PIC值、基因多樣性無較大變化，兩者的地理來源、育成年份高度相關，從側面驗證了本研究SSR標記結果的可靠性。

聚類分析結合代表性品種能夠明晰供試材料的遺傳背景，判斷材料間的親緣遠近。劉少榮等利用5個國家級區域試驗對照品種、2個大面積推廣品種作為代表樣品，將2002—2020年通過審定的青貯玉米劃分為5個大組。楊揚等利用8個當前糯玉米區試對照品種和大面積推廣品種分析了近10年來糯玉米審定品種的年份和地域特征。盧媛等在分析糯玉米自交系SSR標記遺傳多樣性時，也加入了4份與自交系材料相關的雜交種作為內參，用以驗證其結果合理可靠。本研究以京科糯2000、蘇玉糯5號、彩甜糯6號和鄭黃糯2號為代表品種，對東南區41份糯玉米區試材料進行聚類分析，將其劃分為4個遺傳背景不同的組群。根據每個組群材料數量推測，目前東南地區糯玉米雜優模式以京科糯2000為代表的京糯6×BN2為主，該雜優方法創新并建立了硬粒型×馬齒粉質型雜交選育模式，隨著京科糯2000的推廣而逐漸被各個育種單位和育種家借鑒。其次是以蘇玉糯5號為代表的組群Ⅱ，對應的通系5類群×衡白522類群雜優模式在很長一段時間內都是東南區江蘇省糯玉米的主要雜優模式之一。第Ⅲ組代表品種鄭黃糯2號，其母本鄭黃糯03來源于鄭白糯01×鄭58，其父本鄭黃糯04來源于(紫香玉×昌7-2)×昌 7-2， 利用回交轉育將糯質基因導入優質普通玉米中，從而獲得糯玉米新品種，是糯玉米早期的主要育種方式之一。第Ⅳ組材料多為甜糯玉米，其代表品種彩甜糯6號是由白糯玉米自交系T37和紫色甜糯雙隱性自交系WH818雜交選育而來。

不同于普通玉米，糯玉米獨特的鮮食用途決定了其特殊的農藝、品質育種目標，在滿足產量指標的同時盡可能地兼顧營養與口感是育種家對于鮮食糯玉米新品種的總體要求。分析不同遺傳背景下糯玉米材料的農藝、品質性狀差異，能夠在為育種家和育種單位提供導向作用的同時有效利用育種資源，有助于優良品種的選育。本研究通過SSR標記明確了41份糯玉米區試材料的遺傳背景，利用非參數檢驗分析不同遺傳背景下糯玉米的農藝與品質特點，發現了3個組間存在顯著差異的形態學指標，其中籽粒鮮質量為主要的產量性狀之一，含水率則與糯玉米的品嘗口感呈顯著負相關。4個遺傳背景不同的組群在產量、品質性狀上表現出不同的特點：在產量性狀方面，聚類Ⅰ組表現優異，千粒鮮質量高于其他組別，平均產量也高于另外3組；其中Ⅰ組代表品種京科糯2000通過了國家和20多個省份的審定，與其他組代表品種相比，其在區域試驗中所測千粒鮮質量、產量均表現優異。從品嘗口感的角度看，聚類Ⅱ組的含水率較低，且組內品種皮渣率均值也較低，表現出較好的適口性。本研究基于形態學標記、分子標記首次分析了東南地區糯玉米區試材料在不同遺傳背景下農藝及品質性狀表現，可供參考的研究報道較少，其結果可為今后全面了解該地區糯玉米不同雜優模式所育成品種的農藝及品質性狀特點提供依據。