蕓薹屬多倍體雜種減數(shù)分裂中染色體行為研究進展

陳紀鵬， 劉小林， 胡月清

(宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院/江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點實驗室，江西宜春 336000)

多倍化在植物進化歷程中發(fā)揮著巨大作用，植物近緣種間的天然雜交和隨后發(fā)生的基因組自然加倍是推動植物進化、產(chǎn)生新物種的主要動力。細胞遺傳學研究表明，自然界約70%的被子植物是自然進化形成的異源多倍體，而且許多重要的栽培植物也都是自然形成的異源多倍體。比如小麥是在形成史上經(jīng)過2次雜交和2次基因組加倍形成的異源六倍體。白菜型油菜與甘藍雜交再經(jīng)基因組加倍后，經(jīng)歷近萬年的進化演變成當前廣泛種植的甘藍型油菜。另外，像棉花、馬鈴薯等多種重要的栽培作物都在形成史上經(jīng)歷過多倍化歷程。自然界多倍體植物的成功進化為作物遺傳育種指出新的思路。人工合成多倍體雖然表現(xiàn)出植株高大、生長旺盛、適應性強等優(yōu)點，但往往出現(xiàn)配子育性下降、結實率低的缺憾。針對這一問題，人們的目光集中在植物多倍體配子的形成過程中，其中減數(shù)分裂就是配子形成的關鍵階段。

1 蕓薹屬多倍體的形成與演變

蕓薹屬包含大量的栽培植物和野生植物，約占十字花科植物種類的1/10，在我國就有15個栽培種，還形成了多個變種、亞種，如甘藍型油菜、白菜、芥菜等都是重要的油料作物和蔬菜作物，還有些作為藥用植物(如板藍根)和觀賞植物(如諸葛菜)廣泛種植。蕓薹屬植物大多數(shù)具有獨特的農(nóng)藝性狀，如甘藍型油菜具有較高的種子產(chǎn)量和含油量，白菜、卷心菜、苞菜和芥菜等可形成碩大的葉球或膨大的根莖，西蘭花、花椰菜的花序則變形為主要的食用部位。

眾多的種類和多樣的形態(tài)以及重要的經(jīng)濟價值都源自蕓薹屬復雜的遺傳背景。在長期進化和栽培馴化過程中，蕓薹屬經(jīng)歷了多輪多倍化演變形成了龐大而復雜的基因組。20世紀30年代，日本學者Nagaharu提出蕓薹屬3個二倍體基本種和3個四倍體復合種之間的進化關系，即蕓薹屬禹氏三角(圖1)。他指出3個二倍體基本種有白菜(，AA)、黑芥(，BB)與甘藍(，CC)，它們兩兩雜交分別形成甘藍型油菜(，AACC)、芥菜型油菜(，AABB)和埃塞俄比亞芥(，BBCC，簡稱“埃芥”)。又經(jīng)過大量的細胞遺傳學研究，人們提出了蕓薹屬的3個基因組(A、B、C)都起源于同一共同祖先，即單源進化論學說，這種說法后來也得到比較基因組學研究結果的驗證。蕓薹屬基因組起源的問題也存在較大爭議，但有一點共識就是3個基因組都由1個染色體數(shù)目為7的祖先種進化而來。但是，隨著分子生物學技術應用于遺傳研究中來，大量的研究結果顯示，蕓薹屬3個基因組并非起源于1個共同祖先，而是有2個起源，即A和C基因組有1個共同起源，而B基因組由另一個祖先種進化而來。基于保守的同源序列標記和蛋白質(zhì)組學研究結果也支持二源論的說法。

伴隨著多倍化進程，基因組結構也發(fā)生著劇烈的變化，以適應多倍化帶來的基因組沖擊。白菜基因組來源于3個亞基因組(來自同一個7條染色體的祖先)，經(jīng)序列重排、序列消除以及轉(zhuǎn)座子控制的基因沉默，最終形成二倍體白菜。全基因組測序結果顯示，白菜有4萬多個基因，并發(fā)現(xiàn)白菜基因組在進化歷程中的序列消除規(guī)律。RNA-seq技術檢測到甘藍型油菜基因組存在2萬多個SNPs及125 InDels多態(tài)性位點。還發(fā)現(xiàn)重復序列在甘藍基因組中占重要地位，整個基因組有56%的區(qū)域是由重復序列構成的。芥菜型油菜與白菜的全基因組序列比較顯示，2個物種的A基因組只有約45%的序列片段是一致的，芥菜型油菜在進化中發(fā)生了更大的序列變異。還有研究顯示，蕓薹屬植物C基因組比A和B基因組在進化史上保守性更高。分析甘藍型油菜全基因組測序結果得出，它由白菜和甘藍于7 500年前經(jīng)雜交形成。它是當前測序的所有植物中基因數(shù)量最多的物種，大約有10萬個基因維持其生長發(fā)育。測序結果還顯示，白菜A基因組和甘藍C基因組之間存在著廣泛的序列重組。2021年，埃塞俄比亞芥全基因組測序工作完成，結果顯示，17條染色體相連全長1.087 GB，其中重復序列約占58.34%。進一步分析表明，埃芥基因組形成于4萬多年前，早于甘藍型油菜，但晚于芥菜型油菜。多倍化的同時伴隨著發(fā)生的基因組序列變化形成了蕓薹屬復雜的遺傳組成，復雜的遺傳組成不但促使形成了豐富的遺傳資源，還為蕓薹屬多倍體育種提供了廣闊的空間。但是，面臨合成多倍體配子育性差的難題，減數(shù)分裂染色體行為規(guī)律及其遺傳機制的研究顯得尤為重要。

2 蕓薹屬多倍體減數(shù)分裂過程

在絕大多數(shù)真核生物(動物、植物和真菌)中都發(fā)現(xiàn)了有性繁殖方式，而有性繁殖過程中形成雌雄配子的主要過程就是減數(shù)分裂。這是一個復雜的過程，DNA復制1次而細胞分裂2次，第1次分裂(MⅠ)前期同源染色體相互識別并配對與聯(lián)會、重組和分離，隨后進行第2次分裂(MⅡ)。經(jīng)過連續(xù)2次細胞分裂形成配子。減數(shù)分裂不但為有性繁殖提供了染色體數(shù)目減半的配子保證了上下代間的遺傳穩(wěn)定，還通過重組產(chǎn)生了種類多樣的配子，使后代具有豐富的變異基礎。減數(shù)分裂中復雜的染色體行為背后必然隱藏著復雜的遺傳機制，全基因組關聯(lián)分析顯示，甘藍型油菜中存在著與花粉育性有顯著關聯(lián)的區(qū)段，包含、等多個基因，這些基因以各種方式參與減數(shù)分裂中染色體配對、聯(lián)會復合體形成、DNA雙鏈斷裂與修復、同源重組等過程。

2.1 染色體配對

在MⅠ偶線期，同源染色體相互識別并配對。配對的結構和動力學因素來自于染色單體間交叉和著絲粒間連接，交叉的形成受多因素干擾呈現(xiàn)非隨機分布，這些連接點沿染色體縱向延伸最終形成穩(wěn)定結構；同時，端粒之間形成束狀結構有助于輔助同源染色體對齊。在染色單體間交叉、著絲粒和端粒等多因素共同作用下，同源染色體配對并聯(lián)會。二倍體與天然異源多倍體同源染色體發(fā)生精準配對，終變期后分開。染色體配對保證了染色體發(fā)生均等分離，最終形成平衡而有活性的配子。然而在合成多倍體和單倍體中，不但會發(fā)生同源配對，還可能發(fā)生非同源配對，有些染色體也可能不配對。非同源配對導致在MⅠ后期正常的染色體分離規(guī)律變化，發(fā)生不均等分離而形成不平衡配子，往往導致配子敗育。在細胞水平上，多倍體雜種在減數(shù)分裂過程中染色體行為異常而導致配子敗育，此外還有染色體排列混亂、落后染色體或染色體橋等現(xiàn)象。

熒光原位雜交通過探針標記雜種不同基因組，可用于區(qū)分不同基因組的染色體，是研究多倍體雜種基因組互作的可靠技術。以黑芥B基因組為探針進行熒光原位雜交時，信號只出現(xiàn)在B基因組上，A、C基因組上無信號，且靈敏度較高。然而，A、C基因組起源于同一祖先，序列相似度較高，基因組原位雜交易產(chǎn)生信號交叉。因此，只能采用特異性更強的DNA序列做探針，如C基因組特異序列(BoB014O06)作為探針可將熒光信號特異標記在C基因組上。45S核糖體RNA基因和端粒序列也常用作蕓薹屬熒光原位雜交探針，這些探針標記在染色體特定位置，可用于區(qū)分不同的染色體。

由于沒有同源染色體存在，單倍體中基因組內(nèi)或基因組間染色體部分同源關系常引起染色體非同源配對。小孢子培養(yǎng)獲得的蕓薹屬三倍體雜種(ABC)不同基因組間染色體以12%～18% 的頻率發(fā)生非同源配對(A1-C1、A2-C2、A3-C3和 A7-C6)，還有的染色體間發(fā)生頻率較低(小于1%)的非同源配對(A8-C8、A8-C9)。甘藍型油菜與黑芥的雜種(ABC)還檢測到黑芥B基因組與甘藍型油菜的AC基因組間異源配對，三倍體和六倍體雜種異源配對的花粉母細胞分別占38%和15%。白菜單倍體也以較高頻率發(fā)生非同源配對，超過50%的花粉母細胞至少形成3對二價體，而且像同源染色體配對結果一樣，在MⅠ后期配對染色體分開進入不同的子細胞。

合成多倍體中即使存在同源染色體，也可能發(fā)生非同源配對。對合成的蕓薹屬四倍體(AACC、AABB和BBCC)的研究發(fā)現(xiàn)，基因組內(nèi)和基因組間染色體配對水平差異很大，基因組內(nèi)染色體配對的概率小于基因組間配對，配對頻率取決于細胞質(zhì)背景和基因組之間的相互作用。還發(fā)現(xiàn)黑芥B基因組內(nèi)配對頻率小于白菜A與甘藍C基因組內(nèi)配對的頻率，而A與C基因組配對頻率相似。減數(shù)分裂中不同染色體組間非同源配對易造成染色體易位而產(chǎn)生不對等交換。在合成六倍體(AABBCC)中，A基因組與C基因組染色體片段發(fā)生易位，結果就導致花粉育性下降。甘藍型油菜與甘藍雜交形成的三倍體雜種(ACC)減數(shù)分裂中出現(xiàn)染色體排列混亂，而且發(fā)生較高頻率的非同源配對，后期Ⅰ染色體不均等分離。合成多倍體減數(shù)分裂中染色體的非同源配對和單價體還會引起染色體消除，致使染色體組穩(wěn)定性下降。染色體穩(wěn)定性也是影響配子育性的因素，染色體越穩(wěn)定的群體，花粉育性越好，而染色體不穩(wěn)定容易丟失的群體，花粉育性就越差。

2.2 聯(lián)會復合體形成

聯(lián)會復合體(SC)是同源染色體與相關蛋白質(zhì)在聯(lián)會過程中形成的特異結構，它將同源染色體從軸向連接起來，其空間模式影響著配對的染色體雙鏈斷裂和重組的全過程。同源染色體配對時，DNA雙鏈斷裂，而后修復愈合，錯誤的修復將產(chǎn)生交叉，而恢復性修復則不形成交叉。雙鏈斷裂修復以及交叉的形成促使同源染色體折疊成環(huán)狀并彼此靠近，聯(lián)會從斷裂修復位點開始，然后沿著同源染色體軸向延伸，最終形成聯(lián)會復合體。聯(lián)會復合體的形成過程比較復雜，有多種蛋白參與，如拓撲異構酶Ⅱ、凝聚蛋白、內(nèi)聚蛋白和內(nèi)聚蛋白相關蛋白等。在這個過程中，ZIP4作為一個主要平臺，將ZIP2-SPO16復合物與CM1-GMC2連接起來，從而啟動聯(lián)會復合體形成。ZIP4還與ZIP3、MSH5相互作用，后者與伴侶蛋白 MSH4一起穩(wěn)定聯(lián)會復合體結構(圖2)。

采用免疫熒光定位觀察相關蛋白的生成和分布是揭示聯(lián)會復合體形成特征的有效方法。在蕓薹屬3個二倍體和3個四倍體栽培種中均克隆到聯(lián)會輔助蛋白ASY1基因，雖然不同種間存在序列差異，但功能完全相同。在蕓薹屬及其模式植物擬南芥中均發(fā)現(xiàn)，ASY1參與聯(lián)會復合體形成過程，聯(lián)會復合體形成早期，在同源染色體軸向上出現(xiàn)蛋白檢測信號，而后信號位點增多并沿著聯(lián)會復合體軸向延伸，信號幾乎延伸到聯(lián)會同源物的整個長度；當減數(shù)分裂進入終變期聯(lián)會復合體解體時，信號也隨之消失。這表明ASY1的形成與聯(lián)會復合體形成有時間和空間上的相關性。免疫共沉淀反應發(fā)現(xiàn)，在蕓薹屬與擬南芥中還存在與ASY1相互作用的另一種蛋白ASY3，這是一種減數(shù)分裂所需的具有卷曲螺旋結構的蛋白，這2種蛋白在染色體聯(lián)會復合體中相結合形成特定結構共同發(fā)生作用。ASY3突變體中，常發(fā)生非同源染色體聯(lián)會，且交叉難以形成。AtZYP1是一種橫向細絲蛋白，它的作用是促進染色單體間形成交叉。在白菜、甘藍和甘藍型油菜中均發(fā)現(xiàn)與AtZYP1同源的基因，通過基因編輯去除該基因后，在減數(shù)分裂中出現(xiàn)非同源配對頻率增加、同源重組減少和染色體落后等現(xiàn)象。合成蕓薹屬三倍體(ABC)染色體發(fā)生非同源配對時，也在聯(lián)會的位置檢測到ZYP1熒光信號，但與同源聯(lián)會的染色體相比，信號弱且不連續(xù)，表明非同源聯(lián)會其實是2條染色體部分區(qū)段發(fā)生聯(lián)會。在白菜型油菜和擬南芥中，另一種蛋白PCH2在同源染色體聯(lián)會中也發(fā)揮了重要功能，突變體中該蛋白缺失導致交叉減少甚至無法形成交叉。

2.3 DNA雙鏈斷裂與交叉形成

聯(lián)會復合體形成中，DNA雙鏈在拓撲異構酶SPO11蛋白的作用下發(fā)生斷裂(DSBs)，斷裂位點在隨后的修復過程中可能出現(xiàn)原位復合，也可能發(fā)生非恢復愈合形成交叉。在SPO11缺失的情況下，雙鏈斷裂不能形成。甘藍型油菜雙鏈斷裂形成的數(shù)量受基因組結構的影響，較長的染色體雙鏈斷裂位點就較多，而在減數(shù)分裂不需要配對的植物中很少出現(xiàn)雙鏈斷裂位點。DNA雙鏈斷裂修復蛋白RAD51參與DNA的損傷感應和修復，是同源重組過程中的關鍵因子。此蛋白聚集在同源染色體雙鏈斷裂處，可作為雙鏈斷裂的標記。另外，RAD54是調(diào)節(jié)RAD51活性的重要輔助因子，它穩(wěn)定RAD51結構，并刺激其發(fā)揮作用。RAD54的缺失對減數(shù)分裂細胞中的DNA損傷修復具有顯著影響。

雙鏈斷裂后愈合的結果只有非恢復愈合才形成交叉(CO)，在幾乎所有的生物體中，交叉的數(shù)量總是比雙鏈斷裂數(shù)量少得多，可見斷裂修復并不是隨機發(fā)生的。每對同源染色體只有1 個到幾個交叉點，即使在基因組大、染色體長的情況下也是如此，在擬南芥中，30個DSB中只有1個成為交叉。交叉的分布規(guī)律也受基因組背景的干擾，利用蕓薹屬二倍體AA和三倍體 AAC雜交產(chǎn)生非整倍體分析，額外的C基因組使A基因組同源交叉沿著染色體軸向較均勻分布，而在二倍體中交叉分布不均勻，著絲粒附近基本不形成交叉。此現(xiàn)象顯示，物種進化過程中可能形成了抑制交叉發(fā)生的某種機制，但尚不清楚。DMC1基因是已知的減數(shù)分裂特異基因，參與同源染色體DNA雙鏈斷裂修復。蕓薹屬模式植物擬南芥免疫熒光定位結果顯示，DMC1定位于減數(shù)分裂DSB的相對兩側(cè)。DMC1與ASY1共同作用促進同源染色體雙鏈斷點修復。白菜同源四倍體與二倍體相比，聯(lián)會復合體出現(xiàn)異常的同時，DMC1的基因在同源四倍體中顯著下調(diào)表達，這導致白菜同源四倍體減數(shù)分裂異常。DMC1的表達還受環(huán)境條件的影響，如在白菜中，鹽脅迫可刺激其表達，提高植株耐鹽特性。

2.4 同源和非同源重組

交叉的結果DNA片段發(fā)生互換而產(chǎn)生重組，是減數(shù)分裂時染色體正確配對和分離的必要條件。聯(lián)會的雙鏈斷裂與愈合的結果形成交叉，交叉染色體將配對的染色體連接在一起，從而確保它們對齊并使著絲粒與紡綞絲正確連接。未能進行交叉重組的減數(shù)分裂會導致染色體錯誤分離而產(chǎn)生異常配子。在人類中，染色體異常重組和分離通常會導致嚴重的遺傳疾病，如唐氏綜合征。

同源重組確保了同源染色體之間二價體的形成和隨后的均等分離，這也導致后代遺傳多樣性，影響物種對選擇的進化反應。同源重組可防止多價體形成，能有效規(guī)范染色體行為，但也可能破壞遺傳穩(wěn)定性，導致減數(shù)分裂異常。同源染色體之間的重組頻率受植物遺傳組成影響，例如，蕓薹屬四倍體(AACC)與三倍體(AAC)相比，完全相同的同源AA染色體對之間的重組數(shù)量顯著增加。在甘藍型油菜中，重組基本上發(fā)生在同源染色體之間，只有少數(shù)在非同源染色體之間形成。而甘藍型油菜單倍體也能發(fā)生重組，其中同一基因組的染色體之間優(yōu)先發(fā)生重組，然后2個基因組間的染色體之間也發(fā)生非同源重組，非同源重組還造成半數(shù)單倍體后代出現(xiàn)染色體片段重復和丟失。對甘藍型油菜與埃塞俄比亞芥種間雜種(CCAB)微衛(wèi)星標記分析顯示，重組引起的A和B基因組缺失的頻率有很大差異，基因組間非同源重組引起19個A-C、3個A-B和10個B-C間發(fā)生重復/缺失；而2個C基因組間同源重組產(chǎn)生55個缺失和19個重復。重組引起的基因組序列變異拓展了生物遺傳多樣性的遺傳基礎。

3 結論與展望

多倍化改變了植物基因組結構，伴隨著發(fā)生大量的序列變異及表觀遺傳變異。蕓薹屬植物在多倍化進程中基因組發(fā)生了大量的選擇性剪接，不僅使基因組序列發(fā)生了變化，也導致轉(zhuǎn)錄本發(fā)生改變。在蕓薹屬基因組進化過程中還出現(xiàn)不對稱的基因丟失、不對稱的轉(zhuǎn)座元件積累和亞基因組表達優(yōu)勢等情況。與擬南芥同源區(qū)段共線性比較結果顯示，甘藍基因組形成過程中發(fā)生了大量區(qū)段消除和重復等序列變化。多倍化進程中基因組的極不穩(wěn)定使人工合成雜種往往表現(xiàn)出遺傳不穩(wěn)定、育性差和種子產(chǎn)量低等缺陷，使其難以直接用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。配子敗育表面上看屬于細胞遺傳學范疇，但減數(shù)分裂中復雜的染色體行為背后必然隱藏著相應分子遺傳機制。研究支配減數(shù)分裂過程的相應基因作用及其表達調(diào)控規(guī)律是調(diào)控合成蕓薹屬多倍體配子發(fā)育的基本手段。今后蕓薹屬多倍體減數(shù)分裂研究將聚焦在減數(shù)分裂中各染色體行為背后的遺傳機制和開發(fā)調(diào)控多倍體配子發(fā)育遺傳方法等方面。