全球作物基因組編輯技術研發態勢及最新研究進展

趙靜娟， 張曉靜， 李凌云， 楊進孝

(1.北京市農林科學院數據科學與農業經濟研究所，北京 100097；2.北京市農林科學院玉米研究所，北京 100097)

作為全球最矚目的革命性生物技術，基因組編輯技術具備穩定、高效、應用廣泛等特點，在農業生物技術和生物醫學等多個領域發展迅速，已成為生物技術領域世界各國積極布局和激烈角逐的競爭制高點。近年來，基因組編輯技術的研究熱度居高不下，眾多學者針對基因組編輯技術的相關研究進展及其在作物育種中的應用情況進行了一系列的研究報道，廖嘉明等報道了CRISPR/Cas9基因編輯技術的發展及其在植物中的應用。亦有學者從文獻計量的角度出發開展基因編輯發展態勢分析的研究，李東巧等利用定性調研和文獻定量分析的方法，對作物基因組編輯技術的研發現狀、重要國家、重要機構和研究主題進行分析。鐘華等通過分析基因編輯技術相關專利文獻，揭示全球基因編輯技術專利布局與人才現狀，分析了基因編輯技術的發展現狀和趨勢。鑒于基因組編輯技術發展迅速，每年都有大量新成果出現，緊跟最新發展態勢，結合專家研讀，篩選總結最新研究進展，能夠幫助科研人員及時跟蹤最新研究動態，同時為我國在該領域的研發布局和決策提供參考。

本文通過文獻檢索獲取2012—2021年發表的作物基因組編輯技術相關論文，開展該領域發展態勢分析，再以突破性、行業價值、應用范圍等為標準，經情報專家篩選和領域專家判讀，遴選出全球作物基因組編輯技術研究具有代表性的成果，形成作物基因組編輯技術最新研究進展。

1 數據來源及分析方法

1.1 數據來源

本研究的論文數據來自科睿唯安的科學引文索引數據庫(Science Citation Index Expanded，SCIE)，通過基因組編輯技術關鍵詞+作物的檢索策略在數據庫中對相關研究論文進行檢索，共獲得2012—2021年的研究論文3 186篇，發表于2021年的有788篇。其中，作物包括水稻、小麥、大豆、棉花、玉米、馬鈴薯等，篩選的文獻類型包括article和review，數據獲取日期截至2022年3月10日。

1.2 分析方法

(1)統計計量。數據下載后，將數據導入DDA分析工具中進行數據清洗，再利用Excel等工具進行數據分析、統計和圖表繪制。(2)研究熱點分析。運用CiteSpace基于論文的關鍵詞進行主題聚類分析，探索作物基因組編輯技術領域的熱點主題及其發展趨勢。(3)核心文獻遴選。經專家逐篇判讀，遴選出該領域最具代表性和突出進展的最新文獻進行歸納總結。

2 作物基因組編輯技術研發態勢分析

2.1 發文數量年度變化趨勢

近10年(2012—2021年)，作物基因組編輯技術發展迅速，該領域發文年度變化趨勢如圖1所示。2012—2014年間仍為緩慢發展階段，在此期間，作物基因組編輯技術相關研究的發文量緩慢增長；2015年至今為技術快速發展階段。在此階段，作物基因組編輯技術發展迅猛，其發文量呈指數增長趨勢。2021年的發文量比2015年的發文量增長了10多倍，以年均50%的增長率，保持著強勁的增長勢頭。反映了作物基因組編輯技術仍處于研究高峰，是目前該領域的熱點技術。

2.2 重點國家分析

從各國發文數量和趨勢(圖2)來看，早期以美國為代表的發達國家在該領域具有較強的領先優勢，且美國長期保持增長趨勢，位列世界第一。盡管我國在該領域研究起步較晚，但2014年起我國進入快速發展階段，發文量逐漸超越德國、法國、日本等除美國外的其他發達國家，位列世界第二，且發展迅速。2017年，中國在該領域的研究論文首次超過美國，成為該領域年度發文最多的國家，并與其逐年拉開差距，形成絕對優勢。日本、德國分別于1997年、1998年開始相關研究，但是后續研究發文量增長緩慢。印度2013年起開始進入該研究領域，目前呈較快的增長速度，位列世界第三。

從國家合作關系圖(圖3、圖4)來看，前20位(TOP20)國家之間的合作以中國、美國為中心，形成2個合作圈。其中，中國與美國、澳大利亞、巴基斯坦、沙特阿拉伯和土耳其合作較為緊密。美國的合作網絡范圍更大，主要與中國、印度、英國、德國、法國、加拿大、巴西等國合作較為緊密。此外，法國、意大利、新西蘭、西班牙和英國等歐洲國家之間建立了較為緊密的合作關系。中國和美國之間的合作是最為頻繁的，雙方合作發文達234篇。

2.3 主要機構分析

從發文量排名TOP20的機構(圖5)來看，作物基因組編輯技術的基礎研究主要以科研機構和大學為主。其中，中國科學院(223篇)、中國農業科學院(208篇)、中國農業大學(131篇)的發文數量居全球前3位；華中農業大學(128篇)排第4位；南京農業大學(76篇)排第5位，中國研究機構在該領域的研究論文占絕對優勢，前10位(TOP10)機構中占7席。其他3席均為美國的高校。

從機構合作關系(圖6)上來看，TOP10機構之間以各國機構間合作為主，中國科學院與中國農業科學院、中國農業大學、浙江大學之間合作較為緊密；美國的愛荷華州立大學、明尼蘇達大學和佛羅里達大學之間的合作關系也較為密切，主要涉及遺傳轉化、轉錄激活因子、定向誘變和CRISPR-Cpf1系統等內容。此外，中國國家水稻研究所與華中農業大學之間也存在合作關系。

2.4 研究熱點分析

本文運用CiteSpace對2012—2021年的研究論文進行了基于關鍵詞的主題聚類分析，根據聚類結果進行總結歸納，該領域研究熱點(圖7)主要集中在以下3個方面。(1)基因組編輯技術開發和優化，包括引導編輯、堿基編輯、表觀基因組編輯、細胞器基因組編輯、T-DNA free的基因組編輯等技術優化和新功能開發的研究，為基因組編輯技術的應用提供了更多選擇。(2)基因組編輯技術在新種質創制和新品種培育中的應用，包括作物從頭再馴化、利用飽和突變技術創制新種質、利用精確編輯技術創制新種質、利用常規基因組編輯技術創制新種質等研發工作的新進展，其中，近幾年基因組編輯技術在水稻育種中的應用熱度較高，種質發掘、創制和育種的主要方向集中在病害抗性(抗病、抗除草劑)和非生物脅迫抗性(耐鹽、抗旱)等方面，為應對氣候變化，解決糧食安全問題提供支撐。(3)基因組編輯技術監管方面的研究。隨著新技術及其成果在育種中的應用，世界各國均面臨著新育種技術如何監管等問題，該方面的研究熱度不斷攀升，也成為科研人員和政府部門關注的熱點。

作物基因組編輯技術熱點分布圖中出現的聚類主題名稱、強度及其熱點主題詞分布情況見表1。

表1 主題聚類及主題詞分布

3 最新研究進展

本研究在進一步限定刊載在《Nature》《Science》《Cell》《Nature Biotechnology》《Nature Genetics》等權威期刊上的基因組編輯技術最新相關研究論文的基礎上， 再以突破性、行業價值、應用范圍等為標準，經情報專家篩選和領域專家判讀，遴選出全球作物基因組編輯技術三大研究方向中的最新研究成果，逐篇解讀，總結最新研究進展。

3.1 基因組編輯技術開發和優化

3.1.1 引導編輯技術優化 引導編輯(PE)技術無需額外的DNA模板便可有效實現所有12種單堿基的自由轉換，且能有效實現多堿基的精準插入與刪除，這一近乎全能的工具為基因編輯領域帶來重大變革。PE自2019年問世以來，由于操作簡便、靈活性高和編輯精準等特點，得到廣泛關注，但該技術仍存在效率較低的問題。2021年，國內外前沿實驗室利用細胞增效因子篩選、小向導RNA(sgRNA)模板設計、多策略協同效應等方法，進一步提升PE的效率，并拓展PE在大片段基因刪除和替換中的應用。美國哈佛大學劉如謙實驗室與普林斯頓大學Adamso實驗室合作開發的PE升級版本PE4/PE4max及PE5/PE5max為疾病的基因治療提供了更強大的工具。中國科學院遺傳與發育研究所高彩霞研究組與李家洋研究組合作研發了高效設計引導編輯向導RNA(pegRNA)以及提高植物PE效率的新策略。北京市農林科學院楊進孝、趙久然團隊聯合北京大學等單位，發現多種PE增效新策略及協同效應，實現玉米和水稻PE效率平均提高3倍，在多個低效靶點上甚至提高10倍以上，并在人細胞中進行驗證。北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯合中心伊成器教授課題組開發出人源細胞中基于雙pegRNA的高效PE新策略。馬薩諸塞大學的薛文教授課題組和華盛頓大學西雅圖分校Shendure實驗室開發出新一代基因組編輯器，能夠糾正目前較難實現的大片段基因組刪除突變。美國哈佛大學劉如謙實驗室對PE的應用做了進一步的拓展，通過改造PE技術，成功拓展了其應用場景。

3.1.2 堿基編輯技術新突破 單堿基突變占據人類已知致病基因突變的50%以上，在作物優異等位基因的形成中也起著關鍵作用。堿基編輯器是由可編程DNA結合蛋白與堿基修飾酶融合，在不導致DNA雙鏈斷裂的情況下，實現精確修改基因組中的單個堿基。目前比較成功的主要有2種堿基編輯器：胞嘧啶堿基編輯器，能夠將C·G轉換為T·A；以及腺嘌呤堿基編輯器，能夠將A·T轉換為 G·C。然而，對于C·G到G·C的堿基顛換突變，尚不能實現。美國哈佛大學劉如謙等研究人員結合機器學習模型，開發出工程化C·G到G·C堿基編輯器(CGBEs)，首次實現高效的C·G到G·C堿基編輯。

3.1.3 表觀基因組編輯技術新進展 表觀基因組編輯技術研究伴隨著CRISPR/Cas9編輯技術的面世而出現，作為基因組編輯技術發展的一個分支，主要用于基因組位點的表觀遺傳學定向修飾，該技術成果在植物育種領域的應用值得關注。美國加州大學分子、細胞和發育生物學學系的研究人員開發出一個基于細菌甲基轉移酶和CRISPR/Cas9平臺的靶向DNA甲基化工具，可直接甲基化擬南芥中C·G位點的胞嘧啶。

3.1.4 細胞器基因組編輯技術新進展 細胞器基因組是生物體基因組的重要組成部分。由于外部RNA不能進入細胞器，細胞器基因組編輯技術使用的技術原理與常用的CRISPR/Cas9并不相同，因此在這一領域實現突破還存在困難。以下研究是植物細胞器基因組編輯的新突破，開辟了植物基因組編輯技術應用的新戰場。韓國大田基礎科學研究所基因組工程中心開發出一個由16個表達質粒和424個轉錄激活子樣效應子陣列質粒組成的Golden Gate克隆系統。日本東京大學植物分子遺傳學實驗室開發出一種技術，可對植物葉綠體的DNA進行點位突變，但不留下任何遺傳工程技術痕跡。美國密蘇里大學邦德生命科學中心開發出一種高效的水稻葉綠體胞嘧啶堿基編輯系統。

3.1.5 T-DNA free的基因組編輯技術新進展 利用核糖核蛋白(RNP)實現非轉基因的基因組編輯技術多見報道，但效率較低，且僅限于敲除編輯，因此仍需優化改進，同時利用轉座子介導實現自我切除是一條有潛力的替代路徑。以下研究解決了基因組編輯載體即T-DNA實現基因組編輯后的自消除問題，為多年生或不能自交分離實現T-DNA free的植物實現非轉基因的基因組編輯提供了可能。美國馬薩諸塞州總醫院分子病理科和癌癥研究中心用純化的核糖核蛋白復合物進行引導編輯。日本筑波國家農業與食品研究組織農業生物科學研究所開發出介導的轉基因系統，用于CRISPR/Cas9在植物中的暫時表達。

3.2 基因組編輯技術在新種質創制和新品種培育中的應用

3.2.1 作物從頭再馴化工作新進展 利用基因組編輯技術，實現水稻從頭再馴化，這一技術概念大膽新穎，具有一定開創性，是國內為數不多的比肩國際前沿的一項成果。開辟了一條育種新路徑。中國科學院遺傳與發育生物學研究所李家洋團隊聯合國內外多家單位成功實現異源四倍體高稈野生稻的從頭定向馴化。

3.2.2 利用飽和突變技術創制新種質新進展 飽和突變又叫點飽和突變，是使誘導的點突變在目的基因上盡可能稠密地分布以致接近飽和狀態的一種離體非定點的突變，目的是為了篩選出其中的優異等位基因形式。飽和突變的技術概念在人細胞中已經廣泛開展，但在植物中的研究還很少，尤其是在玉米等大宗作物上尚無應用。美國冷泉港實驗室Jackson研究組利用CRISPR/Cas9系統對玉米基因啟動子進行編輯，創制玉米高產等位基因，是首次利用啟動子區飽和突變實現優異等位基因創制，應用于玉米產量提升的研究。

3.2.3 利用精確編輯技術創制新種質新進展 利用精確編輯(同源重組或引導編輯)進行抗病或耐除草劑的新種質創制，是編輯技術的深度應用成果，同時也是精確編輯技術在育種領域不可忽視的應用進展。中國農業科學院作物科學研究所利用廣譜抗性基因的序列為模板，通過CRISPR/Cas9介導的同源替換，成功將感病水稻品種日本晴(Nipponbare)轉化為抗病品系。安徽省農業科學院水稻研究所魏鵬程團隊利用引導編輯工具升級飽和突變方法，為關鍵位點功能挖掘和重要基因充分進化提供新的技術思路。

3.2.4 利用常規基因組編輯技術創制新種質新進展 隨著基因組編輯技術的成熟，該技術在更多大田作物、園藝植物、油料能量植物上開始了更廣泛的應用，成為功能基因研究和新型種質資源創制的新手段。本文總結了2021年結合功能基因信息與基因組編輯技術進行分子育種應用的突出成果。英國洛桑研究所利用CRISPR/Cas9技術敲除了天冬酰胺合成酶基因，使小麥籽粒中游離天冬酰胺的積累量大大減少。北京市農林科學院玉米研究中心趙久然團隊利用全基因組關聯分析、甲基磺酸乙酯(EMS)突變體和CRISPR/Cas9等技術鑒定到與玉米早期耐鹽性相關的重要遺傳位點和基因。北京市農林科學院玉米研究中心趙久然團隊和舜豐生物王飛團隊利用CRISPR/Cas9技術分別創制出利用傳統育種不能或難以獲得的有香米味道的玉米新種質。中國科學院遺傳與發育生物學研究所等機構發現一個從未被認識的控制水稻每穗粒數(GNP)的調控基因——水稻生殖分生組織20()，并證明啟動子的反轉恢復(IR)序列變異可通過基因組編輯或傳統育種方式用于種質改良。中國農業大學姜臨建與青島清原生物技術等單位合作利用CRSPR/Cas9技術創制出除草劑抗性水稻新種質。廣東省農業科學院果樹研究所發現并證明是利用CRISPR/Cas9介導的編輯系統培育長保質期水果的理想靶點。中國農業科學院油料作物研究所首次利用CRISPR/Cas9技術構建油菜籽半矮化、緊湊型花序種質資源。華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室利用CRISPR/Cas9突變基因培育新的甘藍型油菜系。美國俄勒岡州立大學和科羅拉多大學通過利用CRISPR/Cas9技術，在巨尾桉野生型雜交和2個開花位點T()過表達(開花)系中靶向同源基因，從而使桉樹同源基因發生突變。荷蘭瓦赫寧根大學瓦赫寧根植物研究所等機構利用CRISPR/Cas9技術滅活菊苣中所有的基因，開發出不含苦味化合物的菊苣品種。

3.3 基因組編輯技術監管方面的研究

《Nature》2021年發表了多篇有關基因組編輯技術專利共享和監管法規的權威時評。荷蘭瓦赫寧根大學和研究中心宣布將允許全球范圍內的非營利組織免費使用其CRISPR/Cas9基因編輯技術，用于食品和農業的非商業應用；提倡所有擁有CRISPR專利的大學以及公共資助者和世界知識產權組織等國際機構聯合起來，建立更加明確的規則，方便CRISPR相關專利的免費獲取和使用，從而更好地促進CRISPR技術的研究和發展。英國等國家正在積極探索以創新方式管理食品和農業中的基因編輯技術作物的認定和管理方式。加拿大薩斯喀徹溫省大學通過一項歷時多年的調查項目，探索了如何看待新育種技術的風險，包括對基因組編輯作物及其相關的監管要求。調查結果顯示，新興生物技術為應對社會和氣候挑戰提供了巨大的希望，但受社會影響形成的模糊監管環境將限制基因組編輯作物的產業發展。

4 結論與展望

4.1 結論

基因組編輯技術由于其在生物遺傳物質編輯方面的精準、快捷等特點，已成為當前生命科學領域備受矚目的顛覆性技術，近年來發展迅猛。在近10年的論文產出中，中國、美國以突出的發文量，在該領域具備了絕對的領先優勢。已打破之前以美國、法國和德國為代表的歐美發達國家作為作物基因組編輯技術的發源地，占據領先優勢的格局。且中國于2017年起發文量首次超過美國，成為該領域年度發文最多的國家。目前，該領域的基礎研究主要以科研機構和大學為主，尤其是來自中國和美國的機構。其中，中國科學院的研究論文數量位居全球首位，表現較為突出，在作物基因組編輯技術領域的基礎研究具有明顯優勢。多數機構之間保持著密切的合作關系，但還局限于各國內部的機構間的合作。

隨著技術的不斷發展和更替，基因組編輯技術的研究主題也在不斷發生變化：引導編輯技術、堿基編輯技術、表觀基因組編輯技術、細胞器基因組編輯技術、T-DNA free的基因組編輯技術等不斷優化和發展，為基因組編輯技術的應用提供了更多選擇；基因組編輯技術在創制病害抗性(抗病、抗除草劑)和非生物脅迫抗性(耐鹽、抗旱)等方面取得重大進展，為應對氣候變化，解決糧食安全問題提供了解決方案，并在水稻、小麥等重要作物的育種中開展了豐富的實踐探索；基因組編輯作物商業化發展趨勢明顯，其監管問題也成為關注的熱點。

4.2 展望

作物基因組編輯技術的巨大應用前景已成為全球共識，我國對基因組編輯研發同樣高度重視，已將其列為“十四五”時期重點攻關目標。在此背景下，我國首先要強化基因組編輯領域的戰略科技力量，整合國內優秀科研團隊，打造研究方向齊全、應用鏈條暢通、資源積累豐富的創新平臺。加大基礎研究的資金投入，聚焦動植物、微生物、重大疾病及現代農業等多個研究和應用維度，開展技術創新和產業落地。

在基礎研究方面，要著重開發更精準、高效、全面和智能的基因組編輯技術，深入開展基因組編輯分子機制研究、可編程核酸酶結構解析、新工具挖掘、遞送和編輯新技術研發等。同時利用大數據分析和人工智能技術，積極開發CRISPR之外全新的顛覆性基因組編輯技術，推動原創性、顛覆性的基礎研究成果產出。

在技術應用方面，應加快研究成果轉化，目前基因組編輯技術已經在小麥、大豆、棉花、煙草等植物研究中取得顯著進展，未來會在水稻等作物良種選育上發揮更大的作用。未來的實際應用中更趨向于用在植物產量、品質以及非生物和生物抗逆性等方面的改良。這些能力必將改變現有的生物學研究，推動分子遺傳學在作物改良中的發展。此外，該技術在功能基因組學和合成生物學等方面也存在巨大的潛力，必將實現更深層次的技術飛躍。

在產業發展方面，應盡快建立作物基因組編輯技術的監管體系。準確評估基因編輯作物的安全風險，完善政策支撐體系，構建多部門協作體系，強化科普，營造積極、客觀的科技輿情氛圍，增加公眾對CRISPR等基因編輯技術的了解和信任，推進產業落地，搭建以基因編輯技術為支柱的生物經濟，保障我國糧食安全、生命健康和生態安全。