谷子矮稈突變體si-dw4的遺傳分析及基因定位

付 穎， 柴曉嬌， 白曉雷， 王顯瑞， 沈軼男， 張 姼

(赤峰市農牧科學研究所，內蒙古赤峰 024031)

谷子(L.)，又稱為粟，脫殼后稱為小米，具有自花授粉、基因組較小(約430 Mb)、抗旱耐瘠和糧草兼用等特點，是民眾膳食結構改善和種植業結構調整的主體作物。近年來，隨著分子生物學和基因組學研究的不斷深入，谷子已經發展成為禾本科基因組研究的模式植物之一。盡管我國是谷子的起源地，擁有豐富的種質資源，同時依靠六十日、昭谷1號、矮88、噸谷等幾個谷子核心資源的發現和利用，谷子育種已經取得了顯著的進步，但這也造成了遺傳背景狹窄，大多主栽品種仍以中稈和中高稈品種為主。因此，發掘、鑒定和利用新的谷子矮源，已成為實現谷子矮化育種最為直接的手段。此外，谷子高質量全基因組測序的完成及一些矮稈早熟品種高效遺傳轉化體系的建立，也為谷子功能基因組學的研究提供了扎實的基礎。

我國對于谷子矮化機理的研究起歩較晚，前期主要是對谷子矮化突變體進行遺傳分析和生理研究。進入21世紀之后，研究人員才陸續開始對谷子矮化基因進行定位、克隆等研究。高俊華等報道了一個谷子矮稈突變體安矮3號，并將突變基因定位在谷子3號染色體上。錢繼岳通過對47份谷子矮稈材料中矮稈基因的等位性分析，發現獲得的58個矮稈雜交組合中有45個組合含有非等位基因，7個組合含有等位基因。趙美丞在谷子中首次利用圖位克隆的方法分離了自然矮化突變體 84133的半顯性矮稈基因，其編碼一個DELLA蛋白，與赤霉素(GA)信號轉導有關。隨后，谷子隱性矮稈基因和也相繼被發現，分別定位在3號染色體和8號染色體上。近些年來，一些研究人員在谷子矮稈基因的定位、克隆方面已經取得了初步成果，但深入的基因解析尚未開展。目前，國內育種人員利用矮88及其衍生系培育出的品種大多都是中稈品種。同時很多的谷子矮稈種質還普遍存在不同程度的早衰現象，很難在育種中利用。因此，挖掘更多的農藝性狀優良的矮稈資源，就成為了當前谷子矮化育種中亟待解決的問題。

谷子突變體是經過自然突變形成的一個矮稈突變體，其葉片直立，莖稈粗壯，株型緊湊，是優良的谷子矮稈種質資源。本研究以野生型 ZT002為對照，對的表型進行了系統的鑒定分析，同時利用BSA(分離群體分組分析)與QTLseq 相結合的方法對突變基因進行定位，旨在為谷子矮化育種提供可以利用的矮源，豐富和發展谷子矮化的分子機理，為進一步進行分子輔助選擇育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2012年在谷子高稈品種中發現的1株經過自然突變形成的矮稈突變體(命名為)，經過多代自交純合后，其矮化性狀可穩定遺傳，野生型為ZT002。

豫谷1號(Yugu1)是我國夏谷區廣泛栽培的品種，并最早完成了全基因組測序。SSR41是來自韓國的一個地方品種，目前已經完成全基因組測序，該數據由中國農業科學院刁現民課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 遺傳分析群體及作圖群體的構建 2016年夏，將矮稈突變體(母本)與株高正常的Yugu1(父本)和SSR41(父本)分別進行雜交即×Yugu1和×SSR41，該試驗于赤峰市農牧科學研究所試驗站(118°52′0″E、42°17′38″N)進行。2016年冬在海南三亞南濱農場種植2個雜交組合的F代，并分別收集F代真雜種的種子。2017年春在赤峰市農牧科學研究所試驗站種植2個雜交組合的F代群體。2個雜交組合的F代群體均用于基因精細定位，僅有×Yugu1組合的F代群體用來做突變體的遺傳分析。同時，將野生型ZT002也在同一地塊進行種植，用于的表型鑒定。

1.2.2 突變體的表型鑒定及遺傳分析 于植株進入成熟期時，隨機選取6株和ZT002進行相關農藝性狀調查。同時調查和豫谷1號、F及F群體各單株的株高，統計正常株高與矮稈植株的比率，并用卡方測驗分析統計結果。

1.2.3 BSA+QTLseq法進行突變基因的定位 在2組F群體中分別選取30株極端矮稈植株，按單株剪取1～2張健康葉片用于DNA的提取，并測定其濃度，然后將30株單株的DNA 等量混合，分別構建2個矮稈混池。

通過Illumina HiSeq 2500測序平臺對2個混池樣本進行高通量測序，利用QTLseq法對2個混池的測序數據進行比對分析，初步確定突變基因所在的染色體和候選區間，然后在初定位的基礎上利用BSA法進行基因定位。根據重測序得到的親本之間純合的SNP(單核苷酸多態性)和InDel(插入缺失序列)設計多態性好的標記，并利用這些標記定位基因。

2 結果與分析

2.1 突變體si-dw4的表型分析

前期研究發現，突變體葉片直立，莖稈粗壯，穗莖節顯著縮短，株型緊湊，抗倒性強，是優良的谷子矮稈種質資源。在成熟期，對突變體和野生型ZT002 的莖稈部性狀進行調查，發現的株高為35.90 cm，ZT002的株高為130.83 cm，突變體的株高只是野生型ZT002的27.44%(表1，圖1-B)。同時發現的莖稈也更加粗壯，達到10.13 mm(表1)。對突變體與ZT002 的節間進行比對后發現，和ZT002均具有13個節間，并且每一個節間都比野生型中相應的節間短(圖1-A)，這與前人研究結果基本一致，都是由于節間縮短導致的矮化。

表1 突變體 si-dw4和野生型ZT002莖稈部農藝性狀統計

2.2 si-dw4矮稈性狀的遺傳分析

在赤峰和海南連續種植多代，均表現為矮稈性狀。將突變體與具有正常株高的Yugu1做雜交，得到的F代植株全部表現為正常株高，表明矮稈性狀是隱性性狀。在雜交得到的F分離群體中株高分離明顯，存在中間類型，通過測量358株 F群體的株高，發現最矮植株的株高為33.50 cm，最高為142.30 cm，株高位于120.6～130.0 cm區間的植株最多，且符合正態分布規律(圖2)。充分說明F分離群體的株高由主效基因控制，可以把株高性狀看作質量性狀進行分析定位。

2.3 F2群體株高的統計分析

表2 F2代的株高性狀分離情況統計分析

2.4 si-dw4突變基因的定位

對×Yugu1 F和×SSR41 F分離群體的矮稈隱性混池進行高通量測序。對2個混池的測序結果進行比較分析，發現SNP數量在100萬～200萬，InDel在20萬～40萬，利用QTLseq軟件作圖，并不能得到顯著的峰值。因此，本研究利用排除法進行進一步分析，首先將×Yugu1和×SSR41 2個群體都檢測到的變異位點取交集，再利用Yugu1和SSR41的全基因組數據庫內的所有變異位點做過濾，結果發現一半以上變異位點集中在5號染色5～9 Mb區間內， 因此將該區間作為候選區間。根據候選區間內的InDel位點設計了多個標記(表3)，并利用×Yugu1的 F分離群體進行驗證，發現標記In5-6.23和In5-8.12擴增混池 DNA可以得到與母本帶型一致的條帶(圖3)，說明突變基因與這2個標記緊密連鎖。根據重測序分析結果，已經幾乎沒有InDel位點可以使用，再無法設計出InDel標記將定位區間進一步縮小。因此，將突變基因定位于In5-6.23(6 225 727 bp)與 In5-8.12(8 123 723 bp)之間的1.89 Mb 區間內。

表3 基因定位所用的標記

3 討論與結論

3.1 對si-dw4突變基因的分析

本研究中，對突變體和野生型ZT002的節間長度進行調查分析，發現和ZT002的節間數目一致，并沒有發生變化，說明的矮化是由于節間縮短導致的。在前期對突變體農藝性狀的研究中，通過與野生型相比，的葉片呈直立狀，株型也更加緊湊，說明該突變基因也參與了株型的調控。前人研究表明，在水稻中dm、dn和n1這3種矮稈突變體的矮化都是節間明顯縮短而導致的。同樣，在玉米矮稈突變體中，最為明顯的表型特征也是節間的變化，一般多表現為節間數目減少，節間長度縮短，特別是雌穗以下的節間變化尤為明顯。隨著研究的深入，目前在水稻、玉米、茄科和葫蘆科植物中均已鑒定出這類矮稈突變體，它們的突變基因可以使節間數目減少，節間長度縮短，導致植株產生矮化，同時也發現了部分基因兼具株型調控作用，如控制葉片的直立性，使株型緊湊等。當然隨著矮稈種質資源的不斷利用，植物的矮化機理研究已經取得了較大進展，育成的多個矮稈、抗倒、高產、優質的作物品種也得到了迅速推廣。但在谷子矮化育種中，目前可以利用的矮稈資源卻仍然存在早衰和遺傳基礎不明確等問題，導致很難在育種中利用，阻礙了谷子的產業化進程。因而，更多新的矮稈基因的發掘不但可以為谷子矮化育種水平的提高帶來更多的新突破，也為其他農作物、園藝作物的矮化改良提供了先進經驗。

3.2 si-dw4突變基因的精細定位

本研究將突變基因定位在第5染色體1.89 Mb區間內，沒能完成精細定位。一方面由于標記 In5-6.23 與In5-8.12之間已沒有可利用的InDel位點，很難再開發出新的InDel標記；另一方面原因是作圖群體數量較少，構建的遺傳圖譜精度較低，導致進行基因定位時檢測到的重組圖譜偏大而檢測不到重組事件，進而表現為重組交換率偏低。為解決這些問題，本研究計劃一方面基于重測序獲得的SNP位點信息，利用dCAPS Finder 2.0和Primer 3(http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)來開發CAPS(酶切擴增多態性)標記引物，進一步加密遺傳圖譜；另一方面增大作圖群體數量，構建精度更高的遺傳圖譜，精細定位突變基因。