西北地區(qū)大蒜及其野生蒜SSR-PCR體系優(yōu)化及引物篩選

李守明， 史榮梅， 李輝玲

(1.石河子農業(yè)科學研究院，新疆石河子 832000； 2.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，新疆烏魯木齊 830000；3.巴音郭楞蒙古自治州農業(yè)科學研究院，新疆庫爾勒 841000)

大蒜(L.)別稱胡蒜，屬于百合科(Liliaceae) 蔥屬()中重要的蔬菜植物，素有“植物黃金”之稱，大蒜精、深加工品已經產業(yè)化，走俏歐洲、美國。大蒜栽培歷史悠久，最早在地中海沿岸國家栽培，后由張騫從西域引入我國陜西關中地區(qū)，隨后大面積種植，為適應特殊的地理環(huán)境，在長期栽培中形成了不同的生態(tài)型地方品種，其中我國四大名蒜之一就是位于天山北坡吉木薩爾的綠嘴白皮蒜。有效利用大蒜種質資源并對其變異性進行精準評價，單靠極易受環(huán)境影響的形態(tài)特征來評價物種多樣性難度極大，不能全面反映大蒜資源的真實狀況，加上長期無性繁殖導致品種退化嚴重、相互引種導致背景資料缺乏等勢必造成選育和推廣工作滯后等生產問題發(fā)生。

近年來，分子標記技術被廣泛應用于物種親緣關系、品種純度鑒定及遺傳多樣性分析等輔助育種領域。基于轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的簡單重復序列(SSR)標記研究鮮有報道，因此筆者試圖建立適宜西北地區(qū)大蒜及其野生蒜的SSR-PCR分子標記體系，對影響試驗結果的主要因素進行優(yōu)化，以期為后期的種質鑒定、遺傳多樣性分析及構建圖譜等分子標記輔助育種工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試25份大蒜種質資源分別由巴音郭楞蒙古自治州農業(yè)科學研究院特色作物室、新疆維吾爾自治區(qū)農業(yè)科學研究院園藝所收集、提供(表1)，分別于2021年4月初種植于巴音郭楞蒙古自治州農業(yè)科學研究院試驗田內，常規(guī)田間管理。每份資源取葉片200 mg左右，利用天根生化科技(北京)有限公司生產的新型植物基因組DNA提取試劑盒抽提大蒜的DNA。個別未出苗資源以鱗莖作為材料，利用傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法提取DNA。提取的25份大蒜DNA在140 V恒壓下，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測15 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照。另用核酸測定儀(NanoDrop-1000)測定質量及濃度，記錄數(shù)據(jù)后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 25份大蒜種質資源信息

1.2 引物設計與合成

綜合參照Barboza等的研究，共設計50對引物，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

1.3 SSR-PCR擴增體系正交試驗

本著節(jié)約成本并獲得最佳擴增效果的目的，試驗采用總體積為10 μL的體系，引物濃度、模板DNA用量和2×PCR Mix添加量按L(4)正交表設計試驗(表2)，總計16次試驗。擴增程序設定為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，不同引物最佳退火溫度退火45 s，72 ℃延伸90 s；30次循環(huán)的最后1次循環(huán) 72 ℃ 延伸設為10 min，4 ℃保存擴增產物。

表2 SSR-PCR擴增體系正交試驗設計

1.4 退火溫度和循環(huán)數(shù)優(yōu)化

不同引物最適退火溫度()值不同，為提高擴增效果并盡可能考慮到每對引物的最適，采取引物報告單的上、下游引物退火溫度的平均值設定。以SSR7為引物，結合上述擴增效果最優(yōu)參數(shù)配比，對循環(huán)數(shù)進行單因素試驗優(yōu)化，以6份生物學性狀差異較大、親緣關系較遠的大蒜模板DNA為小群體，設置梯度為20、25、30、40次循環(huán)。觀察電泳圖，選擇擴增效果好且條帶清晰的循環(huán)數(shù)。

1.5 電泳檢測

采用6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測擴增結果，電泳儀參數(shù)設置：200 V恒定電壓，80 min。結束后小心拆膠，用銀染法顯色至條帶清晰可辨，在醫(yī)用膠片觀察燈下拍照。參考尚小紅等對擴增結果的直觀分析法進行打分，打分依據(jù)：1～4分表現(xiàn)為清晰條帶少、雜帶多、重復性差、背景模糊，5～8分表現(xiàn)為清晰條帶多、有雜帶、重復性好、背景比較干凈，9～12分表現(xiàn)為清晰條帶多、無雜帶、重復性好、背景清晰，13～16分表現(xiàn)為清晰條帶多、亮度強、無雜帶、重復性好、背景清晰。通過Excel表分析16個組合的均值()和極差()，從而選擇最佳因素配比。

1.6 體系穩(wěn)定性檢測及引物篩選

以6份生物學性狀差異較大、親緣關系較遠的大蒜材料為模板，利用優(yōu)化后的最佳SSR-PCR反應體系和循環(huán)數(shù)，對50對SSR引物進行篩選，最終篩選出條帶清晰可辨、穩(wěn)定性良好的引物作為大蒜材料SSR標記多態(tài)性分析的候選引物。

2 結果與分析

2.1 DNA模板的檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其中14份大蒜材料DNA的質量，具體如圖1所示，可以看出，條帶整齊一致、帶型清晰，材料間DNA濃度較為均勻。核酸檢測儀測定結果顯示，所提DNA的/位于1.85～2.0之間，濃度為61～193 ng/μL。

2.2 SSR-PCR擴增體系的優(yōu)化

擴增結果是PCR體系內各因素相互之間綜合作用產生的，正交試驗16個處理的擴增結果如圖2所示，可以看出，各個因素的濃度組合不同，擴增效果表現(xiàn)出明顯的差異。越大，說明該因素對擴增效果優(yōu)劣影響越大，越大，說明該水平下的擴增效果越好。通過對結果進行評價和數(shù)據(jù)分析(表3)得出：各因素對SSR-PCR體系擴增結果的影響程度依次為模板DNA用量、引物濃度、2×PCR Mix添加量。模板DNA用量為30 ng時效果最好，引物濃度為0.75 μmol/L時效果最好；2×PCR Mix添加量為3 μL時最好。但引物濃度的k與k相差不大，且考慮到條帶的清晰程度，10 μL反應體系以30 ng模版DNA、0.5 μmol/L引物、5 μL的 2×PCR Mix添加量為最佳組合。

表3 建立SSR-PCR反應體系的正交試驗設計表及結果

2.3 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

當循環(huán)數(shù)為20、25次時，擴增結果譜帶模糊；當循環(huán)數(shù)達到30、40次時擴增譜帶清晰易辨。綜合考慮擴增結果質量及總PCR反應時長，最終設定最佳循環(huán)數(shù)為30次(圖3)。

2.4 引物篩選

以6份生物學性狀差異較大、親緣關系較遠的大蒜DNA基因為模板組成小群體篩選，從50對SSR通用引物中最終篩選出13對有效引物(圖4、表4)。圖5為引物SSR7在25份大蒜材料中的SSR擴增結果。

表4 篩選出的13對多態(tài)性SSR引物的序列及其最佳退火溫度

3 討論

3.1 提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

提取高質量的模板DNA是進行SSR-PCR的前提，近年來最簡單的DNA 提取方法是植物基因組DNA提取試劑盒，雖然成本較高，但操作方便快捷、DNA純度高、操作過程毒害少，其應用越來越廣泛。然而取材不同，細胞內的組成成分如多酚類化合物、多糖等會影響DNA的提取質量。大蒜鱗莖中含有比葉片更多的黏液類物質，試劑盒提取效果不如葉片，因此采取傳統(tǒng)的CTAB 法提取，但其操作步驟繁瑣費時，所用異丙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 等有很大毒害。相較之下，試劑盒提取的DNA純度高但濃度過低，傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA純度一般但濃度很高。因此，在模板DNA試驗實際的需求量小時建議使用植物基因組試劑盒提取DNA，需求量較大或者取材干擾物質多時采用傳統(tǒng)的CTAB 法。

3.2 建立大蒜SSR-PCR體系的影響因素

建立穩(wěn)定的PCR反應體系是SSR分析應用的基礎，體系涉及到的諸多因子對整個反應的敏感性、特異性和產量都有較大影響。因此，篩選適合的SSR引物、建立反應體系并進一步優(yōu)化體系，是前期需要開展的必備工作。有研究表明，模板DNA濃度過低會造成反應后條帶不完全或者電泳結果中沒有擴增產物；濃度過高會增加體系中抑制反應的成分含量，出現(xiàn)非特異性擴增現(xiàn)象。引物濃度過低時目標擴增產物的濃度過低或者出現(xiàn)擴增不完全現(xiàn)象，濃度過高則電泳后結果會出現(xiàn)大量引物二聚體。循環(huán)次數(shù)是SSR-PCR擴增反應的關鍵因素；次數(shù)設置過少，目標擴增產物量少，電泳結果不理想；次數(shù)設置過多，消耗完反應物后目標擴增產物不再增加，并會出現(xiàn)非特異性擴增現(xiàn)象。

本試驗借助正交表的均衡分散性和整齊可比性，通過多因素聯(lián)合優(yōu)化的正交試驗設計對影響大蒜DNA SSR反應的2×PCR Mix添加量、引物濃度及模板DNA用量等因子進行優(yōu)化試驗分析，最終得出適合大蒜 SSR-PCR 的反應體系：總體積 10 μ L、模板DNA 30.0 ng、正反引物各0.5 μmol/L、2×PCR Mix 5.0 μL，用dd HO補齊。SSR-PCR擴增程序設定為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，不同引物最佳退火溫度退火45 s，72 ℃延伸90 s；30次循環(huán)的最后1次循環(huán)72 ℃延伸設為 10 min，4 ℃保存擴增產物。以上述最佳反應體系和擴增程序為基礎，進一步在50對通用引物中篩選出高多態(tài)性、重復性良好的13對SSR有效引物，可以為大蒜的品種鑒定、遺傳多樣性等分子輔助研究提供理論和技術支持。