微小RNA-370-3p和Toll樣受體4在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

李博文 韓元圣 黃高俊 鄭磊

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第3大多發性腫瘤，也是第2大癌癥死亡病因[1-2]。目前，結直腸癌的臨床治療仍以手術為主，放療、化療為輔。發病早期多無明顯癥狀，多數病人確診時已是晚期，導致預后較差。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種診斷、治療及與結直腸癌病理發展相關的非編碼小RNA[3]。在眾多miRNA中，miR-370-3p位于人類14號染色體，參與神經膠質瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、卵巢癌、膽管癌等多種腫瘤發病過程[4]。Shen等[5]研究結果顯示，miR-370在結直腸癌病人癌組織中下調表達，并抑制癌細胞的增殖、促進凋亡。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是炎癥、先天免疫、傳染病及炎癥介導的腫瘤發生的主要成分[6]。TLR4是TLR家族的關鍵成員，也是炎癥反應的重要因子。研究表明，多種腫瘤中均檢測到TLR4的異常高表達，并且參與調控癌細胞增殖、侵襲等過程[7]。此外，miR-370-3p還能夠調控炎癥相關信號通路，降低IL-6、IL-1β、TLR4等炎癥因子的表達[8]。Zhang等[8]研究表明，在急性期肺炎病人血清TLR4表達上調，miR-370-3p表達下調，兩者呈負相關。進一步研究發現，TLR4是miR-370-3p的靶基因。本研究檢測miR-370-3p、TLR4在結直腸癌組織中的表達水平，并分析其臨床意義。

對象與方法

一、對象

2016年1月～2018年6月在本院肛腸外科行手術治療的結直腸癌病人146例，術中收集切除的癌組織標本及癌旁組織(距癌組織超過5 cm)。男79例，女67例，年齡<60歲62例， ≥60歲84例，TNM期中81例Ⅰ+Ⅱ期、65例Ⅲ+Ⅳ期。所有研究對象均屬于首次確診原發性結直腸癌，且術后病理檢查證實為結直腸癌。排除標準：術后失訪；伴有其他惡性腫瘤；入院前有放療、化療史；有全身感染性疾病；合并有結腸穿孔、腸道結核等腸道部位疾病。術后隨訪3年，每6個月固定以電話或病人就醫復診形式進行，時間截止至2021年6月。該研究經醫院倫理委員會審核并批準，研究對象自愿參加。

二、方法

1.實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 檢測miR-370-3p和TLR4表達水平：從-80 ℃取出組織標本，經研磨后使用試劑盒提取總RNA，然后在微量核酸分析儀上測定RNA質量；使用PrimeScript RT試劑盒進行逆轉錄；使用SYBR Green染料在ExicyclerTM 96實時熒光檢測系統采集信號。miR-370-3p以U6為內參，TLR4以β-actin為內參，所有序列均送至上海吉瑪制藥技術有限公司合成，引物具體序列及來源均列于表1。采用2-△△Ct法計算表達量。

表1 引物序列

2.免疫組化法檢測TLR4蛋白表達水平：取石蠟包埋的組織切成5 μm厚的切片，二甲苯脫蠟后，酒精水化；加熱收回抗原，然后逐步加入3% H2O2，山羊血清封閉；加入TLR4一抗過夜孵育；加山羊抗兔IgG二抗再次孵育；DAB顯色，蘇木精復染，最后在光學顯微鏡下觀察結果。由兩名研究人員對免疫染色進行評分，TLR4蛋白顯色于細胞膜和細胞質。具體評估標準見表2。最后根據評分結果分為低表達組(≤4分)、高表達組(≥5分)。

表2 染色評分表

三、統計學分析

結果

1.miR-370-3p和TLR4 mRNA表達水平：結直腸癌組織中miR-370-3p表達水平低于癌旁組織；TLR4在癌組織中的mRNA表達水平高于癌旁組織，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-370-3p和TLR4表達水平比較

2.TLR4蛋白表達水平比較：TLR4在結直腸癌組織中的高表達率為40.41%，在癌旁組織中高表達率為13.01%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 TLR4在各組織中免疫組化染色情況(蘇木素染色 ×400)

3.癌組織中miR-370-3p、TLR4表達水平與結直腸癌病人臨床病理特征分析：以癌組織中miR-370-3p表達水平平均值為界限，將結直腸癌病人分為miR-370-3p高表達組(82例)和低表達組(64例)；TLR4的免疫組化結果顯示，其高表達組為59例，低表達組為87例。miR-370-3p、TLR4不同表達水平與病人脈管浸潤、年齡、性別、腫瘤部位、神經浸潤、腫瘤直徑無顯著相關性(P>0.05)，與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移存在差異(P<0.05)。見表4。

表4 miR-370-3p、TLR4表達水平與病人臨床病理特征的關系比較(例)

4.miR-370-3p與TLR4的相關性分析：Targetscan預測顯示miR-370-3p與TLR4存在結合位點，見圖2。Pearson分析結果顯示，結直腸癌組織中miR-370-3p與TLR4呈負相關(r=-0.760，P=0.000)。見圖3。

圖2 miR-370-3p序列中含有與TLR4互補的核苷酸序列

圖3 miR-370-3p與TLR4的相關性分析

5.結直腸癌病人預后不良多因素Cox回歸分析：以單因素分析中有差異的miR-370-3p、TLR4、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移為自變量，以結直腸癌病人預后不良作因變量進行Cox回歸分析，結果顯示miR-370-3p、TNM分期、分化程度、TLR4、淋巴結轉移均是影響預后的因素(P<0.05)。見表5。

表5 Cox回歸分析影響病人預后的因素

6.miR-370-3p、TLR4表達水平與病人生存時間的關系：所有病人術后隨訪3年，146例病人中95例存活，51例死亡，總生存率為65.07%。miR-370-3p高表達組病人的3年累積生存率(78.05%)顯著高于miR-370-3p低表達組(48.44%)(Log-rank χ2=14.309，P=0.000)。TLR4低表達組累積生存率為73.56%高于TLR4高表達組(52.54%)(Log-rank χ2=6.765，P=0.009)。見圖4。

圖4 miR-370-3p、TLR4表達水平與病人生存時間的關系

討論

結直腸癌約占全球癌癥死亡人數的10%，其中女性病人的發病率及死亡率比男性低25%[11]。病理早期的病人預后效果較好，隨著病情加重，晚期病人的預后較差。如果發生腫瘤轉移，將會進一步損害消化系統、骨骼、肺、肝、淋巴等[11-12]。結直腸癌是一種多因素癌癥，使用結腸鏡檢查進行的早期篩查和對分子機制的了解有助于降低其發生率和死亡率。針對血管內皮生長因子受體(VEGFR)的抗體已應用于臨床治療，尋找與結直腸癌有關的分子標志物對改善預后至關重要[13]。

miRNA在腫瘤細胞分化中具有潛在的應用價值。多項研究表明，miR-370-3p參與膀胱癌、神經膠質瘤、甲狀腺癌、膽管癌、卵巢癌等腫瘤發病過程[4]。Shen等[5]的結果顯示，miR-370在結直腸癌組織中表達下調，并且miR-370的表達水平與腫瘤分級呈負相關，通過抑制癌細胞增殖、促進凋亡在結直腸癌中起抑癌作用。在膀胱癌中miR-370表達下調，并與腫瘤惡性轉化高度相關，過表達miR-370能有效阻止癌細胞轉移，miR-370通過靶向SOX12對膀胱癌產生抑制作用[14]。本研究結果表明，與癌旁組織相比，miR-370-3p在癌組織表達水平降低，并與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移存在明顯相關性，說明miR-370-3p可反映病情嚴重程度，與結直腸癌進展密切相關。

TLR是一類在免疫細胞和上皮細胞中表達的模式識別受體，能引發信號轉導，釋放炎性介質，并在免疫反應中起著重要作用。有研究證實，腫瘤周圍的炎性反應也是促進腫瘤發展的必要因素[15]。一項Meta分析結果顯示，TLR3、TLR4、TLR9的高表達與腫瘤病人預后相關，TLR3高表達與病人預后良好相關，TLR4高表達與晚期病人預后不良有關，而TLR9與早期腫瘤病人的預后不良有關[16]。其中，TLR4定位于人17號染色體，不僅能促進炎癥反應的發生，還能誘導細胞分化、增殖，并且能通過多種途徑參與調控腫瘤發生、發展。TLR4表達上調與前列腺癌較高的復發率、乳腺癌的腫瘤大小和遠處轉移、卵巢癌病人較低的生存率有關[17]。楊湘等[18]在喉癌組織中檢測到TLR4高表達，其表達水平與臨床分期、浸潤程度、分化程度及淋巴結轉移有關。Beilmann-Lehtonen等[17]的免疫組化結果顯示，在結直腸癌組織中TLR4高表達與病人較差預后相關。結合本研究結直腸癌組織中TLR4 mRNA及蛋白水平均上升，進一步證實了TLR4在結直腸癌中的高表達。本研究還發現，TLR4表達水平與TNM分期、腫瘤分化、淋巴結轉移程度相關，說明TLR4參與結直腸癌發展過程。

此外，miRNA也是體內炎癥信號的重要調節劑，并參與人類多種炎癥疾病過程。Lin等[4]在潰瘍性結腸炎小鼠模型中發現，miR-370-3p通過靶向TLR4和β-catenin對炎癥反應產生抑制作用，降低了小鼠的死亡率和腫瘤發生。Tian等[19]研究發現，miR-370-3p通過靶向TLR4來減少炎癥反應及氧化應激，從而抑制動脈粥樣硬化。本研究結果表明，癌組織中miR-370-3p與TLR4呈負相關，提示miR-370-3p、TLR4共同參與了結直腸癌病理過程，但其中的機制尚需進一步研究。本研究的Cox分析結果顯示，miR-370-3p、TNM分期、淋巴結轉移、TLR4、分化程度均是影響結直腸癌病人預后的因素(P<0.05)。生存曲線分析發現，miR-370-3p高表達、TLR4低表達的病人3年累積生存率分別顯著高于miR-370-3p低表達、TLR4高表達病人，說明miR-370-3p表達水平高、TLR4表達水平低時結直腸癌病人預后較好。

綜上所述，結直腸癌組織中miR-370-3p低表達、TLR4高表達，miR-370-3p與TLR4呈負相關性，二者表達水平均可影響病人預后。當miR-370-3p高表達、TLR4低表達時病人累積生存率較高。本研究納入的樣本量有限，研究對象存在地域、生活環境等的局限性，后期將擴大樣本繼續研究影響預后的因素以及miR-370-3p與TLR4調控結直腸癌發病的具體機制。