細絲蛋白B在鈣化性主動脈瓣疾病中的表達及其臨床意義

馬名嘉 石娟 劉立剛 魏翔 青瑩

主動脈瓣膜鈣化隨著年齡增長而逐漸加重，最終會引發瓣膜關閉不全和(或)狹窄，導致心力衰竭、心肌梗塞。瓣膜長期受血流沖擊以及細胞老化凋亡影響，瓣膜內大量分布的瓣膜間質細胞(valvular intestinal cells，VICs)發生促纖維化和促成骨過程，在病理條件下，引起瓣膜鈣化[1]，其發生發展受到物理因素和代謝分子調控影響，目前仍無有效預防方法，終末期治療手段是人工瓣膜置換[2]。細絲蛋白B(filamin B,FLNB)是一種肌動蛋白結合蛋白，作為細胞骨架和多功能信號支架，參與細胞凋亡等病理進程。FLNB在各組織中廣泛表達，既往研究聚焦于FLNB突變對骨骼系統發病的影響,它也有可能參與主動脈瓣鈣化進程。我們對人鈣化心臟瓣膜中FLNB的表達進行分析。

對象與方法

一、對象

2021年8月～2022年1月我院手術中切除的鈣化主動脈瓣9例(鈣化組)，女性4例，男性5例。同期因主動脈夾層手術切除的外觀正常的主動脈瓣8例作為對照組，鈣化組病人年齡偏大(見表1)。鈣化性主動脈瓣疾病的診斷標準：心臟彩超檢查提示瓣膜鈣化，術中探查發現主動脈瓣有明顯鈣化結節，直徑超過1 mm。排除感染性心內膜炎、風濕性心臟病以及結締組織病等疾病。所有病人均簽署知情同意書。

表1 兩組病人一般資料比較

二、方法

1.組織樣本處理：將主動脈瓣組織經福爾馬林溶液充分固定后脫水、包埋并切片。另一部分剪碎為米粒大小在液氮中處理后保存于-80 ℃。

2.茜素紅染色：組織切片用2%茜素紅S染色液按標準染色流程染色封片，后于正置顯微鏡下觀察并拍照。

3.免疫組織化學(IHC)SP法染色:采用IHC檢測主動脈瓣中FLNB的表達及其亞細胞定位。按照標準流程進行免疫組化染色，即利用檸檬酸鹽進行抗原修復，并經3%的過氧化氫和8%羊血清室溫封閉非特異性抗原，隨后加入FLNB特異性一抗(1∶100稀釋)4 ℃下孵育過夜，次日用PBS洗滌3次，用二抗孵育60 分鐘，滴加顯色液，顯微鏡下觀察控制顯色時間，蘇木素復染，二甲苯透明后封片。對每張切片在高倍鏡下任取5個區域采集圖像，染色區域取平均光密度值進行比較。

4.蛋白質免疫印跡(Western Blot):進一步應用Western Blot檢測FLNB蛋白表達水平。按文獻[3]，將主動脈瓣組織在液氮中研磨碎，加入裂解液，于冰浴中靜置裂解，用超聲破碎儀進一步破碎，取上清。使用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜。然后抗體封閉，FLNB一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜，孵育二抗，室溫反應30分鐘，洗膜。用ECL顯色，在凝膠成像系統中檢測蛋白信號。

三、統計學分析

結果

1.茜素紅染色結果見圖1A、B。主動脈鈣化組切片可見瓣膜組織層次不清，明顯增生融合，淺紅色組織紋理間有散在深紅色鈣化結節，對照組病人瓣膜切片經染色后為均勻淺紅色質地，未見鈣化結節。

2.瓣膜IHC結果見圖1C、D。IHC染色可以看見，FLNB在鈣化組及對照組切片中均有表達，大部分位于瓣膜組織VICs細胞質中。鈣化組平均光密度定量為(6.57±1.65)%，對照組為(0.91±0.52)%。鈣化組主動脈瓣組織中FLNB蛋白表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

A 正常瓣膜未見鈣化結節(茜素紅染色×400)；B 鈣化瓣膜有散在暗紅色鈣化結節(茜素紅染色×400)；C正常瓣膜少量細絲蛋白B顯色(SP×400)；D鈣化瓣膜細絲蛋白B表達明顯,亞細胞定位于細胞質內，藍染為細胞核(免疫組化染色×400)

3.Western Blot結果見圖2。結果表明，對照組可見FLNB蛋白表達，在鈣化組病人主動脈瓣中，FLNB蛋白表達水平顯著升高，趨勢與免疫組化一致，檢測蛋白條帶灰度值并計算FLNB蛋白/actin蛋白比值，得出相對定量。對照組為(0.352±0.079)，鈣化組為(0.652±0.037)， 兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 細絲蛋白B(FLNB)Western Blot結果

4.FLNB表達與瓣膜鈣化的關系見圖3。以主動脈瓣茜素紅染色后鈣化區域所占視野面積比例表示鈣化程度。瓣膜鈣化程度與FLNB的蛋白表達呈正相關，鈣化程度越嚴重，FLNB表達水平越高，Pearson相關系數r=0.47，差異無統計學意義(P=0.07)。

圖3 鈣化程度與FLNB水平相關性分析

討論

瓣膜鈣化是一種活躍的生物成骨過程，在鈣化的主動脈瓣中可觀察到約13%骨形成[4]。主動脈瓣膜分為纖維層、海綿層和心室面三層，三層內均分布有大量VICs，整個瓣膜結構由一層瓣膜內皮細胞所包裹。在適當條件刺激下，VICs可以分化為成骨細胞，表現為堿性磷酸酶的表達增高。VICs向成纖維細胞分化，促進細胞凋亡，在其周圍形成富含膠原的鈣化結節，導致瓣膜組織彌漫性鈣化[5]。

有研究發現，FLNB可能參與心臟瓣膜疾病的發生。Yang等[6]對一個嚴重骨骼畸形的家系進行全外顯子測序，發現一個FLNB基因移碼突變影響了FLNB二聚體結構的形成。值得注意的是，上述致病突變的攜帶者都同時出現心臟瓣膜病變。本研究從分子表達層面證明FLNB在心臟瓣膜組織中的表達，且主要分布于VICs細胞質當中。FLNB屬于細絲蛋白家族成員之一，在細胞內以二聚體形式存在。二聚體結構的不穩定性很有可能是導致心瓣膜疾病的原因之一。

本研究通過IHC和Western Blot發現，鈣化主動脈瓣組織中FLNB表達增高。FLNB可能在諸多方面對于瓣膜鈣化起到促進作用。有研究發現，VICs在模擬瓣膜硬化條件下培養，與正常VICs對比，前者FLNB基因的表達量顯著增高[7]。本研究結果從蛋白表達水平證實在鈣化瓣膜VICs中的FLNB富集。該現象提示，作為成骨分化的重要分子，FLNB可能直接參與瓣膜鈣化的病理進程。作為細胞骨架構成成分，FLNB可以介導白細胞和內皮細胞的緊密連接，導致白細胞的穿內皮遷移。白細胞在瓣膜內皮下的聚集可繼發炎癥反應，促進瓣膜鈣化[8]。

FLNB功能缺陷會導致一系列病理生理改變。與正常細胞比較，FLNB功能缺陷的成纖維細胞顯示出肌動蛋白微絲紊亂無序、遷移能力下降的現象[2]。若VICs遷移能力下降，將進一步促進瓣膜的融合、增厚。此外，功能缺陷的FLNB會影響其他信號分子。Bandaru等[9]研究發現，FLNB缺陷會增強基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)活性。MMP-9可能參與細胞外基質的纖維增生和鈣化。人體內FLNB突變還會促進β-連環蛋白表達，后者在瓣膜組織中參與調控VIC成骨分化，導致瓣膜鈣化[10]。

本研究樣本為終末期鈣化瓣膜樣本，未能在主動脈瓣鈣化發病早期探究FLNB的表達情況。