功能化聚乳酸-羥基乙酸共聚物基骨組織再生誘導膜的制備及其在大鼠頜骨缺損重建中的應用

劉一鳴 趙云，2 韓梅，2 章雨秋 米方林，2 王冰

1.川北醫學院口腔醫學系，南充 637000；2.川北醫學院附屬醫院口腔科，南充 637000；3.川北醫學院基礎醫學與法醫學院化學教研室，南充 637000

牙周炎是由牙周致病菌及其毒性產物侵犯牙周組織導致的慢性炎癥性疾病，導致牙周支持組織（如牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質）的破壞，最終導致牙齒脫落，嚴重影響患者口腔功能與美觀[1]。牙周炎也是世界上最常見的由微生物引起的疾病之一，嚴重威脅著全球約7.43 億成年人的口腔健康[2-4]。牙周組織再生是牙周治療最理想的結果[5]，骨組織再生誘導術（guided bone regenera‐tion，GBR）是在齦下刮治術和根面平整術的基礎上，利用GBR 膜作為屏障，阻擋上皮結締組織進入骨缺損區并促進牙周膜細胞附著、增殖和分化，進而引導牙周支持組織再生[6-7]。理想的GBR 膜應具有良好的生物相容性，可降解性以及足夠的機械強度以維持空間[8]。目前臨床上常用的GBR 膜主要為來源于動物的膠原蛋白膜，其具有良好的骨組織誘導再生功能和生物降解性。謝苗苗等[9]采用海奧膠原膜行GBR 術修復骨缺損，結果顯示骨生長效果為91.29%±2.37%（P＜0.05）。但膠原膜的不足之處在于其具有免疫原性，降解速度快，且來源較局限。

近年來，基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly-(lactic acid-co-glycolic acid)，PLGA）的靜電紡絲支架材料在組織工程中得到了廣泛應用[10]。靜電紡絲納米纖維膜的結構與細胞外基質（extracellu‐lar matrix，ECM）相似，具有可降解性、可設計性、高比表面積等優點[11-13]。通過負載不同的功能活性物質，調整纖維膜的結構和組成，賦予膜材料除基本功能以外的獨特功能，如促進細胞黏附、增殖及定向分化[14-15]。小鼠顱頂成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）是從C57BL/6 小鼠顱蓋骨細胞中建株的成骨細胞，具有堿性磷酸酶（alkaline phos‐phatase，ALP）活性和基質鈣化等成骨細胞的生物學特性，常作為研究骨代謝的細胞模型[16]。本實驗利用靜電紡絲技術將環狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（cyclo-arginine-glycine-aspartic acid se‐quence，cRGD）、奧硝唑及納米羥磷灰石（nanohydroxyapatite，n-HA）負載于誘導骨組織再生作用的功能層（guided bone regeneration layer，GBRL）及具有抑制纖維化作用的功能層（anti-fibro‐sis layer，AFL），并與具有支撐作用及隔離不同功能層作用的致密膜層（barrier layer，BL）進行復合，得到PLGA基多功能骨組織再生誘導納米纖維復合膜（以下簡稱復合膜）（圖1）。研究不同功能層對MC3T3-E1 及小鼠胚胎成纖維細胞（L929）細胞增殖的影響，研究負載奧硝唑的復合膜對牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gin‐givalis）的抑制作用；構建大鼠頜骨骨缺損模型，研究復合膜誘導骨組織再生的作用并與臨床常用膠原口腔修復膜進行比較，為進一步研究其在牙周炎所致骨缺損修復中的應用打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

PLGA、聚己內酯-丙交酯（poly(ε-lactide-cocaprolactone)，PLCA）、cRGD、奧硝唑、對氧環己酮（polydioxanone，PDO）、n-HA（北京伊諾凱科技有限公司），聚(對氧環己酮-L-苯丙氨酸)（poly(p-dioxanone-co-L-phenylalanine)，PDPA） 為自行制備[17]，P.gingivalis、腦心浸液培養基（brain heart infusion medium，BHI）（寧波明舟生物科技有限公司），L929 細胞系和MC3T3-E1 細胞系及其特定培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司），細胞計數試劑盒（cell counting kit 8，CCK-8）（上海碧云天生物技術有限公司），鈣鹽染色液（Von Kossa 法）、Masson 三色染色試劑盒及蘇木素伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），膠原口腔修復膜（煙臺正海生物科技股份有限公司）。

1.2 復合膜的制備及其表征檢測

1.2.1 流延膜的制備 將0.1 g PLGA、0.05 g PLCA溶于20 mL 二氯甲烷后傾入方形模具（15 cm×15 cm），置于通風櫥內揮發溶劑，得到PLGA/PL‐CA流延膜，室溫真空干燥24 h。

將0.1 g PLGA、0.05 g PLCA、0.8 g PDPA 溶于15 mL 六氟異丙醇，傾入方形模具（15 cm×15 cm），置于通風櫥揮發溶劑，得到PDPA/PLGA/PLCA流延膜，室溫真空干燥24 h。

1.2.2 GBRL 層的制備 將3 g PDO 置于圓底燒瓶，加入300 mg n-HA，抽出圓底燒瓶內空氣，充入氮氣后封瓶，40 ℃超聲30 min使n-HA充分分散于熔融的PDO 中。后置于40 ℃油浴中加入3 mg 辛酸亞錫催化劑，抽空氣充氮氣重復置換瓶內氣體3次后氮氣氛圍下封瓶，將油浴溫度升至100 ℃，攪拌下反應24 h。打開瓶塞，加入20 mL六氟異丙醇后攪拌，使成功接枝聚對氧環己酮（poly(p-dioxa‐none)，PPDO）的n-HA 充分穩定分散于有機相，離心除去未接枝的n-HA，上清液加入無水乙醇50 mL沉降出n-HA-g-PPDO。

將所得n-HA-g-PPDO、0.3 g PLGA 和0.15 g PLCA 溶于9 mL 二氯甲烷和3 mL 二甲基碳酸酯（dimethyl carbonate，DMC）的混合溶液中制得有機相，將3 mg cRGD 和3 mg 奧硝唑溶于0.6 mL 生理鹽水中制得水相，有機相加入100 μL 司盤80 乳化劑，35 000 r·min-1速率攪拌下緩慢滴入水相溶液，形成乳液。乳液置入注射器進行靜電紡絲，電壓8.5 kV，注射器泵流量3 mL·h-1，流延膜固定于接收裝置接收纖維以形成復合膜，接收裝置轉速100 r·min-1，注射器掃描行程20 mm。

1.2.3 AFL 層的制備 將0.2 g PLGA、0.8 g PDPA溶于10 mL 六氟異丙醇置入注射器進行靜電紡絲，電壓8.5 kV，注射器泵流量3 mL·h-1，流延膜固定于接收裝置接收纖維以形成復合膜，接收裝置轉速100 r·min-1，注射器掃描行程20 mm。

1.2.4 復合膜的形態表征 所得系列復合膜列于表1。采用掃描電子顯微鏡（scanning electron micro‐scope，SEM）觀察復合膜GBRL 層的表面形貌；將復合膜修剪至5 mm×5 mm 大小浸泡于模擬體液中，1、2、3、4 周后真空干燥，SEM 觀察復合膜降解后的形貌。

表1 系列復合膜的構成Tab 1 Composition of series of composite membranes

1.3 復合膜體外抑菌及細胞增殖實驗

1.3.1 體外抑菌實驗 稱取3.3 g BHI培養基粉末溶于100 mL 超純水中，攪拌混勻后加熱至沸騰，高壓蒸汽滅菌備用。P. gingivalis復蘇后接種至BHI試管內，用厭氧培養袋密封，搖床140 r·min-1、37 ℃培養48 h。取4 份0.5 麥氏濃度的P.gingivalis菌液，每份100 μL，均勻涂布于血瓊脂平板上，將直徑為6 mm 的復合膜圓片M1、M2、M3 和M4分別置于血瓊脂平板中央，在第3、21天后測量抑菌圈直徑，重復3次取平均值。

1.3.2 細胞增殖實驗 將系列復合膜平鋪于96孔板中，MC3T3-E1 細胞以每孔1×104個的密度分別接種至M1、M2、M3、M4 的GBRL 面，對照組1 將MC3T3-E1 細胞直接接種在96 孔板上，每組設置6個復孔，在37 ℃、5%CO2下培養1、4、7 d[18]，避光條件下使用酶標儀在450 nm 處檢測其光密度值（optical density，OD）。

將系列復合膜平鋪于96 孔板中，L929 細胞以每孔8×103個的密度接種于M1、M2、M3、M4 的AFL 面，對照組2 將L929 細胞直接接種在96 孔板上，每組設置6 個復孔，在37 ℃、5%CO2下培養1、2、3 d[19]，避光條件下使用酶標儀在450 nm 處檢測其OD值。

1.4 大鼠頜骨缺損模型的構建及體內抗菌與成骨修復實驗

選取體重為（200±20）g 雄性SD 大鼠36 只，來源于川北醫學院實驗動物中心［編號：SCXK（川）2013-18］，操作在川北醫學院實驗動物中心進行［SYXK（川）2013-076］，實驗過程對動物的處置符合相關動物倫理學要求。隨機分成6 組，每組6 只，即M1 組、M2 組、M3 組、M4 組、對照（NC）組和膠原（COL）組。戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠頭部固定，下頜部剃毛并用碘伏消毒，沿大鼠下頜骨下緣作約1.5 cm 長切口，鈍性分離各組織，暴露下頜角舌側骨板。生理鹽水沖洗冷卻下，在距下頜骨下緣5 mm 與下頜角后側5 mm交叉處使用牙科手機制備直徑為3 mm 大小的洞穿骨缺損。對于M1 組、M2 組、M3 組和M4 組，將各復合膜貼附于骨缺損處的兩側，其AFL 面貼附于肌肉組織；NC 組不做任何干預；COL 組將膠原口腔修復膜貼附于骨損處雙側。所有分組縫合切口后再次消毒，術后青霉素（8×104U/只）肌肉注射1 次，預防切口感染。大鼠獨立飼養倉喂養，自由飲食。在術后即刻、1周、2周、4周、6周和8周用小動物CT 觀察大鼠頜骨缺損的修復情況，并用Mimics Medical 21.0軟件進行三維重建、測量每只大鼠骨缺損的直徑，并計算每只大鼠的骨體積重建率，骨體積重建率=［（首日骨損體積-各時間點骨損體積）/首日骨損體積］×100%。8周后對大鼠實施安樂死，分離下頜骨后4%多聚甲醛固定48 h。固定完成的標本制備切片，分別進行Von Kossa 染色、HE染色和Masson三色染色，使用光學顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統計學分析

所有數據均采用SPSS 22.0 軟件進行分析，以均數±標準差表示。多組均數的比較用方差分析，P＜0.05記為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復合膜的表征

復合膜M1、M2、M3 和M4 的GBRL 表面的SEM 結果和降解不同時間后SEM 結果（圖2）顯示：各組復合膜的纖維直徑均勻，纖維交叉排列形成類似ECM 的疏松多孔結構；雖然在4 周后纖維出現部分融合，但仍能維持基本的形態，其中M1 降解后的形態與降解初期無明顯差異，這可能是因為M1 僅包含多孔GBRL 層，其AFL 層為PD‐PA/PLGA/PLCA 流延膜，導致其吸水率下降降解變慢所致。

2.2 體外抑菌實驗結果

抑菌圈實驗用來評估復合膜的體外抗菌效果，結果如圖3 所示，未負載奧硝唑的M1 和M2 在第3 天以及第21 天未見明顯抑菌圈，對P.gingiva‐lis無抑制作用；M3 在第3 天的抑菌直徑為（34.2±3.3）mm，第21 天抑菌圈直徑為（31.3±4.7）mm；M4 在第3 天的抑菌圈直徑為（36.51±3.9）mm，第21 天為（33.57±4.6）mm；M3 和M4 的抑菌圈直徑從第3 天到第21 天雖稍有下降，但在21 d 后仍能保持一定的抑菌效果。

2.3 細胞增殖實驗結果

MC3T3-E1 細胞是常見的成骨細胞前體細胞，可以進一步分化為成骨細胞。如圖4A 所示，L929細胞在復合膜AFL 面上均表現出先緩慢增加后降低的生長趨勢，表明M1、M2、M3 和M4 均具有抑制成纖維細胞增長的效果，其中M1 的效果最差，是PDPA在流延層而非多孔AFL層，降解緩慢是L-苯丙氨酸釋放不足所致，這與2.1 中觀察到M1 降解速率低于其他各組的結果是一致的。如圖4B 所示，MC3T3-E1 細胞在M1、M2、M3 和M4的GBRL 層上均表現出良好的增殖趨勢，培養于M1的GBRL層上的細胞增殖速度最快。

2.4 Micro-CT結果

使用Mimics medical 21.0軟件對大鼠下頜骨缺損區域進行觀察，通過分析各組的骨缺損直徑及骨體積重建率來比較各組的骨修復能力。從CT 水平面最大缺損直徑影像比較，NC、COL、M1、M2、M3、M4 組在術后即刻達到最大缺損直徑（圖5A）；從第2 周開始，各組骨缺損直徑均開始減小（圖5B），且COL、M1、M2、M3、M4 組的重建速率均大于NC 組，表明膠原口腔修復膜和各復合膜均能促進骨缺損區域的修復重建，其中M3組重建速率最快，M2 組最慢。在第2 周時可見骨缺損區邊緣稍不整齊（圖5D），缺損區中心可見散在高密度影，4周后各復合膜組缺損區可見明顯高密度影像，至第8 周時，M1、M3 與M4 組骨缺損已基本修復完成。由圖5C 可知，在第2 周，M1、M2、M3 組的骨體積重建率均高于M4 組；在第4至8周，M1、M2、M3和M4組的骨體積重建率均高于NC 和COL 組；在第8 周，NC、COL、M1、M2、M3、M4 組的骨體積重建率均值分別為33.2%、63.4%、82.2%、70.9%、84.8%、75.1%，4種復合膜的誘導骨重建率均高于臨床應用的膠原膜，其中M3組的骨體積重建率最高。

2.5 組織病理學結果

術后8 周，手術部位未脫鈣Masson 三色染色如圖6A 所示，COL 組和復合膜組均可見紅藍相間的新生骨組織，骨組織兩側可見較多成骨細胞分布，對照組骨缺損邊緣較模糊，僅可見少量藍色膠原纖維。Von kossa 染色結果如圖6B 所示，鈣鹽沉積區域呈棕黑色，其中對照、COL和M4組見不連續棕黑色鈣鹽沉積，內有少量條狀或蜂窩狀未完全鈣化的棕灰色區域；M1、M2 和M3 組可見大面積棕黑色鈣鹽沉積，鈣化相對致密。HE 染色結果見圖6C，對照組可見大量炎性細胞浸潤，僅可見少量的成骨細胞；COL 組和復合膜組見毛細血管和新骨生成，M1 和M3 組的部分新骨已開始成熟并出現骨髓腔樣結構。此外從圖6D 可見，膠原組與復合膜組頜骨中被染成藍紅相間的新生骨組織與被染成褐紅色的成熟骨組織有序分布，藍染的膠原纖維較豐富（箭頭所示），而對照組中藍色膠原纖維較少，紅染的結締組織侵入缺損骨組織。

3 討論

本實驗利用靜電紡絲技術制備多功能PLGA基靜電紡絲復合纖維膜，包含貼附結締組織的AFL層、BL層和具有誘導骨組織再生作用的GBRL層。AFL 的主要功能成分為PDPA，其在水中降解可釋放L-苯丙氨酸，抑制成纖維細胞生長[20]。BL 具有一定的強度，在骨修復過程中能夠支撐空間，阻止成纖維細胞等透過屏障膜到達硬組織層，并隔離AFL 降解過程中釋放的L-苯丙氨酸，以免對成骨細胞產生影響，而GBRL 層則包含了有利于成骨細胞貼附的cRGD，誘導成骨細胞增殖及礦化的n-HA，以及抑菌抗生素。如圖2所示，GBRL的表面在SEM 下纖維直徑均勻，纖維交叉排列形成類似ECM 的疏松多孔結構，能夠提供更多的結合位點，促進成骨細胞的黏附和遷移，并且隨著GBRL的降解，能夠實現對抗生素的緩釋[21]。cRGD 為細胞跨膜蛋白整合素的結合位點，可通過整合素介導細胞黏附并轉導生物信號，具有促進成骨相關細胞黏附和分化的能力[22]；羥磷灰石是人體牙齒和骨骼的主要無機成分，有一定的骨傳導能力，能促進缺損骨組織的修復[23-24]；奧硝唑是一種硝基咪唑類抗生素，對各種厭氧菌有較好的抑制作用。

4 種復合膜在模擬體液中浸泡四周仍能維持基本形態，其中M1降解后形態與降解初期無明顯差異，其AFL 層為PDPA/PLGA/PLCA 流延膜，而M2、M3 和M4 的AFL 層為多孔PDPA/PLGA 靜電紡絲膜，M1 比M2、M3、M4 的AFL 層的結構更加致密，導致其吸水率下降降解變慢。Micro-CT影像和組織病理結果也顯示其應用于大鼠體內后也可在較長時間內維持骨修復所需的空間，減少周圍軟組織的壓迫并阻止結締組織的侵入。隨著降解時間的延長，M3 和M4 膜的形態發生變化較大，纖維出現融合，這可能是因為其所含的PLCA的玻璃化轉變溫度低，在水分子長時間的溶脹及塑化作用下分子鏈發生運動融合所致，但仍可以維持基本形態[25]。圖3 中，M3、M4 的抑菌圈較大，這是因為其GBRL 中負載有奧硝唑，其通過材料的降解實現對奧硝唑的緩釋。奧硝唑的緩釋能夠維持局部環境較高的有效藥物濃度，抑制牙周炎主要致病菌P. gingivalis的生長，并且在21 d后仍有較強的抑菌效果，其意義在于避免全身大劑量使用抗生素造成細菌耐藥性和不良反應。

細胞增殖實驗結果（圖4），接種于M1、M2、M3 和M4 的MC3T3-E1 表現出良好的細胞增殖趨勢，其原因可能是靜電紡絲纖維具有與ECM 相似的結構，且比表面積高、孔隙率高，有利于細胞黏 附、增 殖[26-27]；并 且M1、M2、M3 和M4 的GBRL 均負載cRGD，可通過整合素介導細胞黏附和生物信號轉導，可促進細胞黏附增殖[28-29]。在第4 天和第7 天，M1 的MC3T3-E1 細胞OD 值均高于M2、M3、M4（P＜0.05），這可能是因為M1 相較于M2、M3、M4，在4 周之后仍能維持其疏松多孔的結構，具有更大的比表面積，有利于細胞的黏附；且M3、M4 中含有奧硝唑，其細胞毒性對MC3T3-E1 細胞的增殖有一定的影響。L929 細胞增殖實驗結果表明，M1、M2、M3 和M4 均能抑制成纖維細胞增殖，其原因為AFL 層含有PDPA，PDPA 降解釋放L-苯丙氨酸，抑制成纖維細胞增殖。其中M1 對成纖維細胞增殖能力抑制作用最弱，其原因為M1的AFL層為流延膜，降解速度較慢，其PDPA中的L-苯丙氨酸釋放較慢，對成纖維細胞增殖抑制程度較低。

本實驗應用大鼠下頜骨骨缺損模型，驗證復合膜在體內的骨修復作用，應用影像學定量分析M1、M2、M3、M4、COL 組和對照組在術后即刻、第2 周、第4 周、第6 周和第8 周的新骨形成情況。如圖5B 所示，在第8 周，M1、M2、M3、M4 及COL 組的最大缺損直徑均小于NC 組，且從圖5C 中同樣可以看出M1、M2、M3、M4 組的骨體積重建率均高于COL 組和NC 組，這是因為具有梯度結構的復合膜既能依靠AFL 層的降解釋放L-苯丙氨酸抑制結締組織異常增生，GBRL層負載的cRGD 及n-HA 又能促進成骨細胞的黏附增殖。在不同復合膜中，又以M3修復效果最佳，這是因為相較于M1 來說，M3 的GBRL 層中額外負載了奧硝唑，降低了與植入物相關感染的可能性[30]，減少其對骨修復的影響，而M1 與M3 相比，其AFL 層降解速度較慢，對成纖維細胞增殖抑制作用差（圖4B），這一點與圖6D 的結果相一致；而M2 中同樣不含有奧硝唑，圖6A 中也可以看到其有大量的炎細胞浸潤，這在一定程度上延緩了骨修復的進展；而M4 與M3 相比，其GBRL 中缺少n-HA，羥磷灰石的骨引導作用能夠加速骨缺損組織的修復。組織切片染色也與影像學分析一致：M1、M3 和M4 組條帶狀新生骨組織內可見大量藍色膠原纖維，骨組織兩側可見較多成骨細胞成片分布，表明其成骨細胞生長活躍；M1、M2、M3、M4 組較NC 組與COL 組均未見軟組織侵入骨組織，表明復合膜起到了良好的屏障作用，有效地阻擋了成纖維細胞的干擾。綜上，M1、M2、M3和M4 均有良好的促進骨組織再生能力，其中M3的骨修復能力最為突出。

綜上所述，本實驗采用乳液靜電紡絲技術成功制備負載cRGD、奧硝唑和n-HA 的PLGA 基多層復合膜。該復合膜纖維直徑均勻，具有疏松多孔的三維結構，生物相容性良好，體外抑菌實驗表明其對P. gingivalis具有一定的抑制作用。大鼠頜骨骨缺損模型結果表明，其體內抗菌及骨修復能力良好，極有潛力應用于誘導牙周疾病所致牙周骨缺損的修復。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。