春化基因 Vrn-1對二系雜交小麥親本抽穗期的作用研究

陳現朝，廖祥政，高建剛，楊衛兵，侯起嶺，劉江峰，張風廷，張勝全

(北京市農林科學院雜交小麥研究所，北京 100097)

雜交小麥具有提高小麥產量的潛力。二系雜交小麥是利用光溫敏不育系和恢復系雜交，在產量、抗逆性等性狀上均優于親本或對照品種的雜交小麥品種。小麥雜交種往往需要外源小麥花粉進行制種，自花授粉的小麥因制種親本花期不遇或株高差異等問題，導致制種產量低且不穩定。這是限制二系雜交小麥品種走向市場的主要因素之一。研究表明，制種親本抽穗期差異較大，是導致制種產量不穩定的主要因素之一。研究遺傳和環境因素對二系雜交小麥親本抽穗期的作用，篩選抽穗期穩定的材料并通過播期協調其發育進程，對于穩定二系雜交小麥的制種產量具有重要的意義。

與小麥抽穗期相關的基因有春化基因()、光周期基因()和早熟基因()。迄今為止，已有多個研究利用 PCR 擴增技術和凝膠電泳技術對春化基因、光周期基因在小麥中的組成和分布進行了檢測，并對春化基因和光周期基因在小麥抽穗期的作用進行了研究，結果表明，春化基因和光周期基因的組成、分布與品種特性和生態區域相適應；但部分研究因種植區域不同，基因效應有所差異。Padovan等研究了基因、環境和播期對地中海地區硬粒小麥產量的作用，提出不同區域應選擇適宜的品種及配套播期等栽培措施來提高產量。Kiss等通過 2011 年秋播和 2012 年春播，對不同播期的小麥抽穗期進行了研究，發現小麥抽穗期與光周期基因相關，而春化基因對小麥抽穗期的作用不顯著。但春化基因對抽穗期的作用，需在不同環境或多年試驗條件下進一步驗證。2016年Rasheed等基于春化基因的STS標記開發了KASP標記，并對國內外小麥品種的分布及其對抽穗期的作用進行了檢測。與STS標記相比，KASP 標記對基因組SNP 位點的變異檢測更為簡便高效，且成本較低，因此成為種質資源評價和篩選的主要技術手段。但利用KASP標記對二系雜交小麥抽穗期穩定性的研究卻鮮有報道。

本研究以34份不育系和96份恢復系為試驗材料，利用春化基因的7個KASP功能標記，對其在不育系和恢復系的組成和分布進行檢測。并于2018-2019和2019-2020兩個年度種植在河南鄧州，以播種至抽穗的日歷日和生長度日為指標，研究春化基因對二系雜交小麥親本抽穗期的作用，分析攜帶不同等位基因親本的抽穗期穩定性，以期獲得抽穗期穩定的材料，為獲得制種產量穩定的二系雜交小麥親本組合提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2018-2019和 2019-2020 兩個年度在北京市農林科學院河南鄧州雜交小麥產業化試驗基地(32.68°N，112.08°E)進行。供試材料共 130 份，其中二系雜交小麥骨干光溫敏不育系 34 份(在鄧州地區常年10月25日播種，不育度大于95%)，骨干恢復系 96 份(其中12份為外部引進品種，84份為本研究所改良的高恢復力材料)。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗設計及表型調查

2018年和2019年，34份不育系分別于10月13日和10月19日播種，96份恢復系分別于10月19日和10月27日播種。每個材料種植2行，每行30粒，行長1.5 m，行距25 cm。采用隨機區組設計，2個重復。施用小麥專用復合肥(N∶P∶K為 25∶14∶7)，化肥全部基施，按照一般大田管理技術進行管理。參照宋彥霞等的方法對抽穗期進行田間調查。播種至抽穗的日期為抽穗期的日歷日。

1.2.2 春化基因的檢測

參考Rasheed等報道的7個KASP標記(Vrn-A1_9K0001、Vrn1_new、Vrn-A1b-Marq、Exon7_C/T_ Vrn-A1、Vrn-B1_A、Vrn-B1_B和Vrn-D1-D1a_A)對春化基因進行檢測。具體引物序列信息如表1所示。根據KASP技術的要求，FAM引物5′端加上特異性接頭GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，HEX引物5′端加上特異性接頭GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。于小麥返青期，剪取小麥葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)提取基因組DNA，濃度在10～30 ng·μL之間。以基因組DNA為模板，分別用7對KASP標記引物進行PCR擴增。PCR反應體系為10 μL，包括cDNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，2×ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，南京)5 μL，ddHO 3.6 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃退火(選用Touchdown程序，每個循環降低0.6 ℃)1 min，擴增10個循環；94 ℃變性20 s，55 ℃延伸 1 min，繼續擴增26個循環。待PCR擴增產物溫度降至40 ℃ 以下時，通過酶標儀FAM、HEX光束掃描讀取熒光值，用LGC公司開發的SNP viewer 2.0軟件讀取檢測數據。試驗結果剔除雜合和缺失位點樣本，用Excel統計不育系和恢復系材料中、和位點等位基因的分布頻率。

表1 檢測 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1等位基因所用的引物信息

1.2.3 溫度信息的采集

1.3 數據處理

用Microsoft Excel 2019對數據進行整理，用SPSS 25.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1的組成及分布

結果(表2)發現，供試材料以冬性材料為主。7個標記 Vrn-A1_9K0001、Vrn1_new、Vrn-A1b-Marq、Exon7_C/T_Vrn-A1、Vrn-B1_A、Vrn-B1_B和Vrn-D1-D1a_A在供試材料中主要檢測到5個等位基因。除了未檢測出目的條帶的材料外，、2147 type、、Hereward-type 是不育系和恢復系中的主要等位基因類型，分布頻率分別為 88.24%和84.38%、44.12%和54.17%、88.24%和28.13%、82.35%和 92.70%；是不育系和恢復系中的主要等位基因類型，分布頻率分別為 52.94% 和 61.45%。由表3可知，供試材料包含39種春化基因型，其中1號、3號、4號、5號、7號、9號、10號、13號、18號基因型在不育系和恢復系均存在，分別占不育系和恢復系的76.48%和46.87%。

表2 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1基因在不育系和恢復系中的組成和分布頻率

2.2 播期和春化基因 Vrn-1對二系雜交小麥親本抽穗期的影響

由表3可知，1號、3號、4號和5號四個基因型在供試材料中的分布頻率較大。因此，本研究以1號、3號、4號和5號四個基因型的不育系和恢復系為研究對象，以播種至抽穗的日歷日和生長度日為指標，研究播期和春化基因對不育系和恢復系抽穗期的作用。對供試材料2018-2019和2019-2020兩個年度播種至抽穗的日歷日和生長度日進行顯著性比較分析，從表4 可以看出，兩個年度不育系和恢復系間播種至抽穗的生長度日差異均達到極顯著水平，但播種至抽穗的日歷日因年度變化而不同；其中2018-2019年度不育系和恢復系間差異極顯著，2019-2020年差異不顯著。

表3 Vrn-A1、 Vrn-B1 和 Vrn-D1 基因型的組成和分布頻率

表4 不育系和恢復系播種至抽穗的日歷日和生長度日顯著性比較

為進一步闡明不同基因型親本的抽穗期穩定性，選擇1號、3號、4號和5號四個基因型的不育系和恢復系為材料，在2018-2019和2019-2020兩個年度對不育系和恢復系組合間播種至抽穗的日歷日和生長度日進行顯著性比較分析，結果(表 5)表明，1號、3號、4號和5號四個基因型的不育系和恢復系組合間播種至抽穗的日歷日差值和生長度日差值因組合不同而表現不同。且不育系和恢復系在不同組合間和不同年度間播種至抽穗的日歷日差值不穩定。對不育系和恢復系組合間生長度日差值而言，組合“3號×3號”、“3號×4號”在兩個年度間的穩定性較好，2018-2019和 2019-2020兩個年度播種至抽穗的生長度日差值分別為-96.3和-90.3 ℃·d、-118.9和-122.0 ℃·d，差異達極顯著水平；組合“5號×4號”在兩個年度播種至抽穗的生長度日差值穩定性最差，2018-2019和 2019-2020兩個年度分別為-110.7和-84.0 ℃·d，差異達極顯著和顯著水平。

表5 不育系和恢復系不同基因型組合播種至抽穗的日歷日差異和生長度日差異

3 討 論

3.1 小麥春化基因 Vrn-1的組成和分布

明確二系雜交小麥親本春化基因的組成和分布，可為其在制種產量穩定性方面奠定基礎。Zhang等對春化基因、、和在不同麥區的組成及分布進行了研究，發現顯性等位基因的分布頻率自北向南逐漸增加，其中在黃淮冬麥區的分布頻率為36.1%，而在長江中下游冬麥區和西南麥區的分布頻率為64.1%，且僅含有春化顯性等位基因；隱性等位基因在華北平原冬麥區的分布頻率為100%，在黃淮麥區也有分布。本研究結果表明，二系雜交小麥骨干親本春化基因以顯性基因型為主，占比80%以上，該結果比Zhang等的研究結果(53.0%)有所提高，這可能與材料來源不同有關。本研究供試材料群體春化基因變異較少，且主效等位基因幾乎無變異。這可能與二系雜交小麥不育系在北京(可育)、鄧州(不育)兩地進行穿梭育種有關，供試材料經過人工定向選育和兩種自然環境雙重選擇壓力，群體春化基因變異較小。

3.2 小麥春化基因 Vrn-1在小麥抽穗期的作用

小麥發育既受春化和光周期基因調控，也受光照和溫度影響。Zhang等發現，攜帶的小麥材料抽穗期最早，攜帶和的材料次之。本研究供試材料不育系和恢復系組合“3號×4號”在2018-2019和2019-2020兩個年度中的穩定性較好，原因可能是組合“3號×4號”在和位點的等位基因存在差異，而在位點上相同。因此，為篩選抽穗期穩定的小麥，應進一步通過分子標記輔助鑒定并篩選不育系和恢復系春化基因型組合“3號×4號”的小麥進行制種。

此外，由于本研究僅基于基因的KASP標記對二系雜交小麥親本抽穗期的作用進行研究。未能分析其他春化基因、光周期基因或早熟基因對二系雜交小麥親本抽穗期的作用。因此，下一步應結合STS標記研究其他春化基因(如)和光周期基因的等位基因組合對二系雜交小麥親本抽穗期的作用。

3.3 抽穗期與生長度日的關系

小麥生長發育需要的積溫相對穩定，但由于年度間或不同播期小麥發育進程溫度變化不穩定和光照時長的差異，以小麥播種至抽穗的日歷日為小麥發育進程的指標不夠準確。本研究比較攜帶不同春化基因型的小麥播種至抽穗的日歷日差異和生長度日差異，發現攜帶相同春化基因型的小麥播種至抽穗的生長度日較日歷日更穩定。同時，由于小麥發育階段的基礎溫度因品種或發育階段有所不同，本研究利用0 ℃作為小麥播種至抽穗的基礎溫度不夠準確，導致不同基因型小麥播種至抽穗的生長度日在年度間有所變動。

綜上所述，以小麥生長度日為播種至抽穗的指標，以春化基因的KASP功能標記輔助篩選到不育系和恢復系春化基因型組合為“3號×4號”且抽穗期穩定的材料，并結合鄧州地區光溫特性調整播期以協調其發育進程，為穩定并提高二系雜交小麥制種產量提供科學依據。