青稞鐮孢根腐病病原鑒定及致病性分析

李雪萍，李敏權，許世洋，劉梅金，漆永紅，李建軍，李曉蓉

(1.甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農業大學草業學院，甘肅蘭州 730070；3.甘南州農業科學研究所，甘肅合作 747000；4.甘肅省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，甘肅蘭州 730070)

青稞是青藏高原地區裸粒大麥(L.var.nudum)的統稱，其成熟期短、耐寒性強，是我國藏區及古埃及人民的傳統糧食作物。研究發現，青稞富含多種氨基酸、維生素、膳食纖維、β-葡聚糖以及鈣、鎂、磷、鋅、錳、硒等礦質元素，在增加胃動力、降低血脂、防治糖尿病、高原病等方面有獨特的保健作用，且符合現代人類“三高兩低”(高蛋白、高纖維、高維生素和低脂肪、低糖)的飲食結構需要。是健康食品加工、釀酒等的主要原料。青稞病害的發生對其生產造成了嚴重的威脅。大麥根腐病是一種世界性病害，在澳大利亞、加拿大、美國及我國青藏高原地區發生頻繁。國外對大麥根腐病的研究發現，能引起大麥類作物根腐病的病原以鐮孢菌(spp)、麥根腐平臍蠕孢()和絲核菌(spp.)為主，優勢病原因地而異，如美國明尼蘇達州大麥根腐病的病原是禾谷鐮孢，加拿大魁北克大麥根腐病的病原為麥根腐平臍蠕孢()，愛德華王子島的大麥根腐病的優勢病原為燕麥鐮孢()等。國內對包括青稞在內的大麥根腐病尚未全面明確其病原。

青稞是甘肅省甘南藏族自治州人民的糧飼兼用作物，青稞產業向好發展是當地人民生活水平及生態安全的保障，但根腐病發生普遍，為害嚴重。青稞感染根腐病后，品質下降，減產15%～30%，嚴重時顆粒無收；根和芽的鮮重和干重、株粒數均顯著減少，從而導致其總產量降低；感病植株的干物質積累量下降23.28%～82.77%，脂肪含量下降28.45%～79.25%，蛋白質含量下降0.55%～76.62%。因此，青稞根腐病的防控工作迫在眉睫。本研究以甘肅省甘南州青稞為研究對象，調查其根腐病的發生率，記錄發病癥狀，并采集樣品分離其病原，采用形態鑒定和分子鑒定相結合的方法確定其分類地位，檢測其致病特性，明確病害類型，為青稞根腐病的流行監測和防控工作夯實基礎。

1 材料與方法

1.1 調查采樣

2015年至2017年間，在青稞生長期的苗期及成株期，多次對甘肅省甘南州合作市、臨潭縣、卓尼縣等不同區域的青稞根腐病進行調查，估算田間發病率，記錄發病癥狀，并采集樣品，低溫運輸至實驗室對其病原進行分離鑒定。

1.2 分離純化

將青稞植株根部清洗干凈后，于超凈工作臺中從根部病健交界處剪下根段放入裝有70%乙醇的小燒杯中浸2～3 s后，在0.1%的升汞溶液中消毒10 s，用無菌水涮洗4次，放在已滅菌的濾紙上吸干；用無菌解剖刀切去根段兩端，接入PDA平板；約3～4 d后，及時將根段兩端長出的菌絲轉接到另一PDA平板，即分離成功。經顯微觀察，待所分離的菌株產孢后，用單孢分離法將其純化，于-80 ℃保存備用。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態鑒定

觀察記錄純培養菌株在PSA培養基上的形態特征，測定其4 d時的菌落直徑，在400倍光學顯微鏡下觀察經CLA培養基培養后的孢子形態，參照《鐮刀菌屬》確定其種屬。

1.3.2 分子鑒定

根據形態鑒定結果每個菌種隨機選取2～5株進行分子鑒定。將待鑒定的菌株在PDA培養基平板上25 ℃培養5 d后，接種于馬鈴薯葡萄糖培養液中，120 r·min、25 ℃搖床培養5 d，收集菌絲體，按照Fungal DNA Kit試劑盒說明書提取DNA。選取ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、EF-1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和EF-2(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)作為引物對鐮孢菌基因組DNA進行PCR擴增。反應體系為 25 μL，包括基因組DNA 1.0 μL、10×Buffer(含2.5 mmol·LMg)2.5 μL、Taq聚合酶(5 U·μL)0.5 μL、dNTP(10 mmol·L)1.0 μL、Primer(±10 μmol·L)1 μL，ddHO補至25 μL，輕彈混勻，瞬時離心收集管壁上的液滴。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取2 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒參照說明書進行回收；目的產物送北京天一輝遠生物科技有限公司測序(測序儀為ABI3730-XL)，將獲得的序列拼接后于NCBI中進行序列比對，利用MEGA7構建系統發育樹，1 000次重復，得到分子鑒定結果，并提交至NCBI系統，獲得GenBank登錄號。

1.4 致病性測定及相關指標計算

分別采用燒杯水瓊脂法和盆栽法測定分離菌株的致病性，其中，發病率(%)=發病幼苗數/幼苗總數×100%；病情指數(DI)=(∑各級發病株數×病害分級值)/最高病害分級值×種子總數×100。

燒杯水瓊脂法致病性分級標準：0級：健康無病，葉綠，根與根莖白；1級：根系有褐色斑點出現，但不超過30%；2級：根系成段變褐，但不縊縮發干，不超過30%；3級：根系成段變褐甚至變黑，縊縮發干，不超過50%；4級：根系成段變褐甚至變黑，縊縮發干，大于50%；或整個植株死亡。

盆栽法致病性分級標準：0級：健康無病；1級：根基部變褐，不軟腐，不縊縮，葉子健康，根無明顯病斑；2級：根基部及莖稈變褐，并有明顯縊縮，葉尖或葉片發黃，根變褐；3級：根基部變褐腐爛，葉片發黃，根變褐甚至變黑；4級：根及根基部腐爛，整株幼苗壞死。

供試青稞品種為鐮孢根腐病感病品種藏青2000，由甘南藏族自治州農業科學研究所提供。

將經致病性測定后的病株每個重復隨機挑取3株，輕輕剪下其病根，接種于PSA培養基上，于25 ℃下培養7～10 d后，觀察其孢子形態、培養特征，確認與接入時是否一致，將一致的確認為青稞根腐病的病原。

根據分離純化、鑒定結果及致病性測定結果，統計各病原菌的分離率(各病原菌株數與總菌株數的比率)及檢出率(各病原菌從樣本中的檢出概率)，通過計算青稞根腐病各病原的種間致病力，確定優勢病原。絕對發病率(%)=種內所有菌株的平均發病率；相對發病率(%)=絕對發病率×分離率；絕對病情指數=種內所有菌株的平均病情指數；相對病情指數=絕對病情指數×分離率。優勢病原為相對發病率及病情指數較高的種。

1.5 數據統計及分析

基因序列的處理及系統發育樹的構建采用CLUSTALX1.83、MEGA7完成；數據用Excel 2007和DPS 15.10整理和分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 發病狀況分析

對甘肅省甘南藏族自治州15個不同區域的青稞鐮孢根腐病進行調查(表1)，發現青稞鐮孢根腐病的發病率為5%～20%，苗期發病癥狀主要表現為長勢弱，不同程度的發黃或萎蔫，多有莖基部變褐、縊縮腐爛，種子根變褐、發干萎縮，嚴重時整株死亡；成株期發病癥狀多表現為穗白、粒癟，莖稈發褐或黑紅，根及莖基部縊縮發干或腐爛等(圖1)。共得到病樣30份，苗期18份，成株期12份。

a：苗期田間發病癥狀；b:苗期發病植株根部癥狀；c：成株期田間發病癥狀；d：成株期發病植株根部癥狀。

表1 青稞根腐病采樣地點及發病率

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態特征鑒定

從30份病樣中共分離純化得到D1-1、D1-2等(表2)88株絲狀真菌，其中D1-2等61株菌在PSA培養基上培養4 d平均菌落直徑為4.8 cm，呈白色絨毛狀，多數產玫紅色和黃色色素，生長至7～10 d后，菌落正面呈淺黃棕色，背面玫紅色變得濃重，趨于暗紅色，菌絲變為氈狀；經CLA培養基培養后，大型分生孢子形態一致，呈彎曲鐮刀狀，有明顯的頂細胞和足細胞，4～7個分隔，平均大小為39.76～60.53 μm×3.03～4.56 μm，為燕麥鐮孢(圖2a1、a2、a3)。D1-1等15株菌在PSA培養基上培養4 d的平均菌落直徑為5.7 cm，呈白色絨毛狀，產黃褐色色素，偶產淡粉色色素；生長至7～10 d后，絨毛狀菌絲逐漸退化，與培養基緊密結合，呈黃褐色輻射狀；經CLA培養基培養后，其分生孢子形態一致，呈鐮刀狀，彎曲度大，頂細胞長，足細胞明顯，4～7個分隔，平均大小為38.94～53.02 μm× 3.27～4.53 μm，為木賊鐮孢(圖2b1、b2、b3)。D10-1等4株菌在PSA培養基上培養4 d的平均菌落直徑為5.4 cm，呈白色絨毛狀，產玫紅色色素，隨著培養時間的延長，白色的氣生菌絲退化變稀薄；在CLA培養基上產生大小分生孢子，大型分生孢子鐮刀狀，彎曲，有明顯的足細胞，3～5個分隔，平均大小為32.02～51.24 μm×4.08～4.69 μm，小型分生孢子卵形或梨形，為三線鐮孢(圖2c1、c2、c3)。D14-1等4株菌在PSA培養基上呈白色叢卷毛狀或氈狀，氣生菌絲稀疏，呈輻射狀，產淡黃褐色至灰棕色色素，在PSA及CLA培養基上的培養物均未發現孢子，菌落形態如圖2d1、d2、d3、d4所示，暫不能確定種，有待分子鑒定。D22-1與D32-1兩株菌在PSA培養基上培養4 d的平均菌落直徑為5.3 cm，呈白色絨毛狀，氣生菌絲發達，產生濃重的玫紅色色素；培養至7～10 d后，氣生菌絲變黃疏散，最終呈棕紅色；在CLA培養基上分生孢子形狀較一致，3～7個分隔，鐮刀狀，平均大小為26.06～40.64 μm×2.82～4.89 μm，有足細胞和頂細胞，為銳頂鐮孢(圖2e1、e2、e3)。D29-2與D29-3兩株菌在PSA培養基上呈白色近氈狀，產少量的淡黃褐色色素，未發現孢子，菌落形態如圖2f1、f2所示，為。

a1、a2、a3：燕麥鐮孢(Fusarium avenaceum)；b1、b2、b3：木賊鐮孢(Fusarium equiseti)；c1、c2、c3：三線鐮孢(Fusarium tricinctum)；d1、d2、d3、d4：柔毛鐮孢(Fusarium flocciferum)；e1、e2、e3：銳頂鐮孢(Fusarium acuminatum)；f1、f2：Fusarium langsethiae；a1、b1、c1、d1、d3、e1、f1：菌落背面；a2、b2、c2、d2、d4、e2、f2：菌落正面；a3、b3、c3、e3：孢子形態。

2.2.2 分子鑒定

如圖3和圖4所示，基于ITS及TEF序列構建系統發育樹發現，D1-2、D7-3、D15a-1、D23-6、D23-4、D24-4、D25-2、D33-1共8株菌與燕麥鐮孢的遺傳距離為0，自展支持率大于90，與形態鑒定結果一致。D22-2、D32-1與銳頂鐮孢的遺傳距離為0，基于ITS序列的自展支持率為91，基于TEF序列的自展支持率為97，與形態鑒定結果相同。D14-1、D15b-1、D27-1與柔毛鐮孢的遺傳距離為0，自展支持率大于85，鑒定為柔毛鐮孢。D29-2、D29-3與的遺傳距離為0，自展支持率99，鑒定為。D1-1、D20-2、D25-1與木賊鐮孢的遺傳距離為0，基于ITS序列的自展支持率為99，基于TEF序列的自展支持率為98，與形態鑒定結果相同。D10-1、D10-2、D23-3與三線鐮孢的遺傳距離為0，自展支持率為91，與形態鑒定結果相同。以上結果說明，分子及形態鑒定結果可靠，提交至NCBI獲得的登錄號分別為KY365564(D25-1)，KY365572(D23-3)，KY365576(D10-1)，KY365577(D10-2)，KY365591(D29-2)，KY365592(D29-3)KY365594(D27-1)，KY365595(D22-2)，KY365596(D32-1)，KY365597(D23-4)，KY365598(D24-4)，KY365599(D23-6)，KY365600(D25-2)，KY365601(D33-1)，KY365603(D1-1)，KY365604(D20-2)，KY365605(D14-1)，KY365606(D15b-1)，KY365607(D1-2)，KY365608(D7-3)，KY365610(D15a-1)。

圖3 基于ITS序列的青稞鐮孢根腐病病原系統發育樹

圖4 基于TEF序列的青稞鐮孢根腐病病原系統發育樹

2.3 分離菌株的致病性與再分離結果分析

所分離的88株鐮孢菌均有不同程度的致病性(表2)，兩種方法中青稞發病癥狀與田間苗期發病植株癥狀一致。燒杯水瓊脂法測定結果顯示，燕麥鐮孢、木賊鐮孢、三線鐮孢和柔毛鐮孢的多數菌株間發病率及病情指數差異顯著，燕麥鐮孢有29株菌發病率達100%，最低為46.67%，病情指數最高達82.5(D20-1)，最低為15(D24-2)；木賊鐮孢亦有多株菌發病率達100%，最低為 63.33%(D15b-2)，病情指數最高為57.83(D13-2)，最低為27.17(D1-3)，各菌株之間致病力差異不顯著；4株三線鐮孢中D23-3的發病率和病情指數均最高，分別為100%和89.17，最低發病率則為81.67%(D10-1)，最低病情指數為33.33(D10-2)，各菌株間的致病力差異顯著；4株柔毛鐮孢最高發病率達100%(D32-4)，最低80%(D14-1)，病情指數最高41.67(D14-1)，最低 10.17(D27-1)；2株銳頂鐮孢的發病率均為100%，病情指數分別為74.17和67.5，差異顯著。2株發病率差異不顯著，病情指數分別為 46.67和33.33。對相同菌株，盆栽法得到的發病率和病情指數較燒杯水瓊脂法有不同程度降低，但整體趨勢相同。

表2 接種鐮孢菌菌株的青稞發病率及其病情指數

對發病植株的致病菌再次分離鑒定發現，其形態與接入時一致，符合柯赫氏法則。因此，確認燕麥鐮孢、木賊鐮孢、三線鐮孢、柔毛鐮孢、銳頂鐮孢及6種鐮孢菌為該區青稞根腐病的主要病原，并確定該類根腐病為鐮孢根腐。

2.4 致病性測定方法及病原分析

2.4.1 致病性測定方法對發病率和病情指數結果的影響

對燒杯水瓊脂法和盆栽法兩種方法得到的發病率及病情指數進行檢驗，發現這兩種方法所測得的發病率及病情指數差異極顯著(< 0.01)。對其進行回歸分析(圖5和圖6)，燒杯水瓊脂法和盆栽法所測得的發病率及病情指數均呈線性正相關，發病率的相關系數為0.87，病情指數的相關系數則達0.92，相關性均顯著，說明燒杯水瓊脂法與盆栽法所反映的菌株發病率及病情指數的程度是一致的。

圖5 燒杯水瓊脂法與盆栽法所測發病率回歸分析

圖6 燒杯水瓊脂法與盆栽法所測病情指數回歸分析

2.4.2 青稞根腐病鐮孢菌的種類

共分離得到88株青稞鐮孢根腐病病原菌，苗期50株，成株期38株，苗期鐮孢根腐病的病原為燕麥鐮孢、木賊鐮孢、三線鐮孢及柔毛鐮孢，成株期鐮孢根腐病病原更多樣，除苗期4種鐮孢菌外，還有銳頂鐮孢及。但無論是苗期還是成株期，燕麥鐮孢的分離率及檢出率均最高，其次是木賊鐮孢。其中，苗期燕麥鐮孢的分離率為66%，檢出率78%；成株期分離率則為74%，檢出率達92%。從檢出率來看，除木賊鐮孢外，成株期較苗期各病原的檢出程度均較高(表3)。

表3 青稞鐮孢根腐病病原組成及分離率

2.4.3 青稞根腐病鐮孢菌優勢種

通過對燒杯水瓊脂法測定的各菌株種間綜合致病力分析發現，青稞苗期根腐病的絕對發病率以木賊鐮孢最高，達94.97%，成株期則以銳頂鐮孢和三線鐮孢最高，柔毛鐮孢次之。苗期絕對病情指數以燕麥鐮孢最高，為46.53，成株期則三線鐮孢最高，銳頂鐮孢次之。相對發病率及病情指數無論苗期還是成株期均燕麥鐮孢最高，木賊鐮孢次之。因此，確認燕麥鐮孢為青稞鐮孢根腐病的優勢病原(表4)。

表4 鐮孢菌種間綜合致病力分析(燒杯水瓊脂法)

通過對盆栽法測定的各菌株種間綜合致病力分析發現，青稞苗期根腐病的絕對發病率柔毛鐮孢最高，為89.17%，與燒杯水瓊脂法的結果不一致；成株期為銳頂鐮孢和三線鐮孢最高，達100%，與燒杯水瓊脂法所測得的結果一致。絕對病情指數苗期以柔毛鐮孢最高，為39.17，與燒杯水瓊脂法所得結果不一致；成株期則三線鐮孢最高，為85.83，與燒杯水瓊脂法測定結果一致。相對發病率及病情指數無論苗期還是成株期以燕麥鐮孢最高，木賊鐮孢次之，與燒杯水瓊脂法所得結果完全一致。因此，得出燕麥鐮孢為青稞鐮孢根腐病的優勢病原。

表5 鐮孢菌種間綜合致病病力分析(盆栽法)

3 討 論

鐮孢菌分布范圍廣，能引起小麥、玉米、蔬菜、中藥材等的多種病害，如小麥冠腐病，玉米莖腐病、鞘腐病及穗腐病，水稻立枯病，大豆根腐病，甜瓜枯萎病，豇豆根腐病，萵苣葉斑病，以及黨參莖基腐，滇黃精根莖腐病，鐵皮石斛根腐病等中藥材病害。本研究首次對甘肅省甘南藏族自治州青稞鐮孢根腐病從苗期至成株期進行了詳細的調查研究，明確了甘南藏族自治州青稞苗期根腐病病原為燕麥鐮孢、木賊鐮孢、三線鐮孢、柔毛鐮孢4種，成株期病原為燕麥鐮孢、木賊鐮孢、三線鐮孢、柔毛鐮孢、銳頂鐮孢及共6種，由此可見，病原種類可因生長時期的不同而不同。但無論是苗期還是成株期，燕麥鐮孢均為優勢病原，這可能與各采樣區生態環境有關。因此，在甘南藏族自治州目前青稞生產中，應高度重視燕麥鐮孢的防治，同時也應該重視如木賊鐮孢等致病力較強的病原種群。

在鐮孢菌鑒定方面，產孢菌株通過形態鑒定均能確定到種，因此對產孢菌株只隨機挑選了部分菌株進行分子鑒定。有研究表明，通過測定編碼轉錄延伸因子區(TEF-1α)的序列進行鐮孢菌的分子鑒定成功率較高且準確。但本研究在鑒定過程中發現，三線鐮孢和銳頂鐮孢的部分菌株通過測定該區序列并未能鑒定到種，反而測定其核糖體內部轉錄間隔區(ITS)的序列可以鑒定到種，且BLAST比對結果100%相似，通過構建的系統發育樹發現遺傳距離為零。木賊鐮孢則是無論測其ITS區序列還是TEF區序列均能將其很好的鑒定到種。燕麥鐮孢等其他鐮刀菌均測定其TEF區的序列即可很好地鑒定到種。說明大多數鐮刀菌可以基于TEF序列鑒定，少數TEF區基因序列鑒定不到種的菌株，可以測定其ITS序列鑒定或通過多個基因序列進行鑒定。

對根腐病病原菌致病性測定的方法有多種，如平皿法、試管苗法、卷紙法、盆栽法等，致病性的測定結果也因測定方法的不同而不同。本研究將平皿法改良為燒杯水瓊脂法，使青稞根和莖葉能很好地生長，更有利于準確地統計病級，且保留了平皿法的簡便性。為了結果更為準確，同時進行了盆栽試驗，發現燒杯水瓊脂法所測定的菌株的致病性高于盆栽法測定結果，且差異極顯著。但回歸分析表明，兩種方法所測定的致病性結果呈線性正相關，且相關性顯著，說明兩種方法對菌株發病率及病情指數的反映程度是一致的，如菌株D7-4、D20-2等無論是用燒杯水瓊脂法還是盆栽法所測定的致病性與同組其他菌株相比都是最高的。因此，在后續試驗中可以采用燒杯水瓊脂法進行致病性測定，較盆栽法而言，其所需要的材料簡單，操作過程省時省力，且無菌操作過程更易控制，誤差較小。