PD-1/ICOS信號轉換受體通過增強CD19-CAR-T細胞增殖能力提高其對DLBCL的殺傷活性*

加爾寶·吐爾德 阿迪娜·賈庫林 聞淑娟

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 1.淋巴瘤內科;2.乳腺放療科，新疆 烏魯木齊 830011)

彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一種高度侵襲性和異質性的腫瘤，是非霍奇金淋巴瘤最常見的形式[1-2]。隨著新型靶向治療的發展，大部分DLBCL患者可以治愈[3]。然而，仍有40%～50%的DLBCL患者表現為難治性或復發的特點，最終死于疾病進展[4-5]。因此，DLBCL的治療還需要探尋更多的治療手段。

靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)已被批準用于復發難治性彌漫大B細胞淋巴瘤[6]。然而，免疫抑制微環境的存在顯著削弱了CAR-T細胞在臨床應用中的療效[7-8]。前期研究[9-10]發現，PD-L1在DLBCL中顯著高表達, 是此類患者不良預后因素。阻斷PD-1/PD-L1信號是一種有效的增強B細胞淋巴瘤免疫應答的手段[11]。此外，研究[12-13]顯示，包含ICOS胞內結構域的CAR增強了CAR-T細胞的效應功能和體內持久性。

在本研究中，為了逆轉PD-1/PD-L1信號對T細胞的抑制作用，同時基于ICOS胞內結構域可以增強T細胞的效應功能和體內持久性的特點，我們將PD-1受體的胞外結構域與ICOS受體的胞內信號域融合，并將這種嵌合受體共表達在CD19-CAR-T細胞中，來探索這種新型CAR-T細胞對DLBCL的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑、實驗動物及血液樣本 彌漫大B細胞淋巴瘤細胞DB購自武漢普諾賽生物科技有限公司。細胞培養基為RPMI-1640+10%胎牛血清，細胞培養在37℃，5% CO2條件下。過表達luciferase的DB細胞由本實驗室先前構建保存。Ficol試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；CD3/CD28磁珠購自美國Invitrogen公司；IL-2購自美國Peprotech公司；Polybrene購自美國sigma公司；CFSE試劑購自美國Invitrogen公司；LDH細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；熒光素酶底物購自上海翌圣生物科技有限公司；FITC標記的CD19蛋白購自北京Acro公司；PE標記的抗Myc抗體，PE標記的抗CD69抗體購自美國Biolegend公司；FITC標記的抗CD3抗體，PE標記的抗CD4抗體，APC標記的抗CD8抗體購自北京義翹神州有限公司；過表達CD19-CAR以及過表達PD-1/ICOS-CD19-CAR的慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司。15只5周齡大小的雌性NCG小鼠(體重在23 g左右)購自新疆醫科大學，小鼠飼養SPF屏障環境中，所有動物實驗都經過我院倫理委員會批準。志愿者招募自我院體檢中心3例健康體檢者，其中男2例，女1例，平均年齡45歲(年齡范圍40～49歲)，平均BMI為37.6 kg/m2(BMI范圍為35.5～38.2 kg/m2)，每位志愿者抽取20 mL的外周血，抽血程序經過我院倫理委員會批準，志愿者簽署知情同意書。

1.2 慢病毒感染法構建bbz以及PD-1/ICOS-bbz 按照制造商的說明，使用Ficol試劑從外周血中分離外周血單核細胞，然后按3∶1的磁珠與細胞比例加入CD3/CD28磁珠，在室溫孵育30 min，之后將磁珠細胞混合物放入專用磁力架中靜置5 min，連同磁力架一起傾倒管中的液體，之后用完全培養基將試管中的磁珠細胞混合物按1×106/mL重懸，培養48 h后，按MOI值為10分別加入過表達CD19-CAR以及過表達PD-1/ICOS-CD19-CAR的慢病毒，并額外添加6 μg/mL的polybrene，在水平離心機中按800 g離心90 min，之后放入培養箱中靜置培養。24 h后更換新鮮的完全培養基，并在感染72 h后使用流式檢測CAR-T細胞的陽性率。

1.3 流式細胞術檢測bbz以及PD-1/ICOS-bbz的陽性率 分別取3×105個未感染的T細胞(Mock)，bbz以及PD-1/ICOS-bbz，PBS清洗3次后使用100 μL PBS重懸，之后加入5 μL PE標記的抗Myc抗體以及FITC標記的CD19蛋白，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細胞儀進行檢測，結果使用Flowjo V10進行處理。

1.4 流式細胞術檢測長期共孵育后T細胞中CD69的表達情況 分別取2×106個bbz以及PD-1/ICOS-bbz，按照試劑盒的說明用CFSE染料進行標記，之后按照效靶比為2∶1與DB細胞共孵育，每隔7 d加入新鮮的DB細胞，共添加3次，在共孵育35 d后，取20 μL細胞懸液，PBS清洗3次后使用100 μL PBS重懸，之后加入5 μL PE標記的抗CD69抗體，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細胞儀進行檢測，結果使用Flowjo V10進行處理。

1.5 流式細胞術檢測長期共孵育后T細胞的增殖情況 按照1.4的共孵育方法，每隔7 d取50 μL細胞懸液，利用T細胞標記CFSE的特性，使用流式細胞儀對CFSE+的細胞進行計數，以此來統計T細胞的增殖情況。

1.6 LDH釋放法檢測bbz以及PD-1/ICOS-bbz對靶細胞的細胞毒性 按照1.4的共孵育方法，在共孵育結束后，取2×106個細胞混合物，按照3∶1的磁珠與細胞比例加入CD3/CD28磁珠，在室溫孵育30 min，之后將磁珠細胞混合物放入專用磁力架中靜置5 min，連同磁力架一起傾倒管中的液體，得到T細胞。再按照效靶比為2∶1與DB細胞共孵育24 h，期間不添加任何細胞因子，之后按照制造商的說明使用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測對靶細胞的細胞毒性。計算公式為：細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度) / (細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100。

1.7 體內移植瘤模型檢測PD-1/ICOS-bbz的體內抗腫瘤活性 取5×106個DB-luciferase細胞，重懸于200 μL PBS中，通過尾靜脈回輸至NCG小鼠體內，接種7 d后，所有小鼠均成功長出腫瘤，將15只小鼠分為3組(Mock組，bbz組及PD-1/ICOS-bbz組，每組5只小鼠)，通過尾靜脈分別回輸1×107個效應細胞，在接種腫瘤細胞后第14 d腹腔注射1 mg/kg的luciferase底物，并通過活體成像儀對體內的腫瘤細胞進行成像。之后密切監控小鼠的死亡情況。

1.8 流式細胞術檢測小鼠外周血中T細胞的比例 通過眼眶采血取50 μL小鼠外周血，使用350 μL紅細胞裂解液室溫裂解3 min，之后加入1 mL PBS混勻，清洗3次后，加入FITC標記的抗CD3抗體，PE標記的抗CD4抗體，APC標記的抗CD8抗體，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細胞儀進行檢測，結果使用Flowjo V10進行處理。

2 結果

2.1 慢病毒感染法構建bbz以及PD-1/ICOS-bbz 流式細胞術檢測bbz及PD-1/ICOS-bbz的陽性率，結果顯示，bbz和PD-1/ICOS-bbz中CD19-CAR的陽性率分別為31.1%和36.3%(見圖1A)，而只有PD-1/ICOS-bbz中表達PD-1/ICOS嵌合受體，陽性率為42.2%，見圖1B。

圖1 bbz和PD-1/ICOS-bbz的表征

2.2 長期共孵育后PD-1/ICOS-bbz的激活水平更高 在經過35 d的體外共孵育后，流式細胞術檢測T細胞表面激活marker的表達情況，結果表明，PD-1/ICOS-bbz較bbz CD69的表達水平顯著提高(P<0.001),見圖2。

圖2 長期共孵育后bbz和PD-1/ICOS-bbz的激活

2.3 長期共孵育后PD-1/ICOS-bbz的增殖能力和細胞毒性水平更高 細胞增殖結果顯示，在長期共孵育過程中PD-1/ICOS-bbz較bbz增殖能力顯著提高(P<0.01)(見圖3A)。此外，共孵育結束后取T細胞與DB細胞共孵育，結果表明，PD-1/ICOS-bbz較bbz對靶細胞的細胞毒性更高(P<0.01),見圖3B。

圖3 bbz和PD-1/ICOS-bbz長期共孵育后的增殖和細胞毒性

2.4 PD-1/ICOS-bbz顯著清除小鼠體內的淋巴瘤細胞 使用小鼠移植瘤模型評估PD-1/ICOS-bbz體內抗腫瘤活性，活體成像結果顯示，在第14 d時PD-1/ICOS-bbz治療組體內腫瘤被完全清除，而bbz組仍有存活部分腫瘤細胞(見圖4A)。生存結果顯示，bbz治療組的小鼠在43 d時已全部死亡，而PD-1/ICOS-bbz治療組的小鼠在70 d時仍全部存活(P<0.01),見圖4B。

圖4 bbz和PD-1/ICOS-bbz對DB細胞的體內抗腫瘤活性

2.5 PD-1/ICOS-bbz具有更強的體內增殖能力 流式結果顯示，PD-1/ICOS-bbz治療組中外周血CD3+T細胞的數目較bbz組顯著增多(見圖5A)，且PD-1/ICOS-bbz治療組的T細胞具有更多的CD8+T細胞的比例，表明其腫瘤殺傷能力更強，見圖5B。

圖5 bbz和PD-1/ICOS-bbz在體內的增殖

3 討論

CAR-T細胞被認為是一種有效的B細胞淋巴瘤的治療手段[14]。然而，現存的CAR-T細胞對復發/難治性DLBCL患者的療效有限，客觀緩解率只能維持在60%左右[15-16]。為了進一步提高CAR-T細胞對DLBCL療效，降低腫瘤微環境的影響，我們構建了共表達信號轉換受體的增強型CAR-T細胞。結果表明，含有PD-1/ICOS信號轉換受體的CD19-CAR-T細胞能夠特異性清除表達CD19的DLBCL，有效延長小鼠的生存期。此外，與二代的CD19-CAR-T細胞相比，含有PD-1/ICOS信號轉換受體的CD19-CAR-T細胞具有顯著的增殖優勢，這種特性使PD-1/ICOS-bbz具有更強的臨床應用潛力，因為到目前為止，大部分報道的經CAR-T細胞治療失敗的DLBCL患者，其外周血CAR-T細胞擴增都令人失望[17]。既往研究[18]報道，長期慢性刺激CAR-T細胞可導致其衰竭。而在本研究中，體外結果顯示，在經過長期刺激后，PD-1/ICOS-bbz較bbz仍具有更好的腫瘤殺傷活性。

通過回輸CAR-T細胞可以在體內產生有效的抗腫瘤作用，然而大多數腫瘤會采取多種策略來實現免疫逃逸。這種逃逸策略大致可以分為兩類，一種是防止T細胞識別的策略，如目標抗原和主要組織相容性復合體表達下調[19-20]；還有就是通過限制T細胞持久性和效應功能的策略，如抑制配體/受體(如CTLA-4、PD-1和LAG-3)的表達[21-22]。研究人員已經通過設計抑制配體阻斷劑，證明可以增強抗腫瘤免疫反應[23]。但系統性施用這類藥物往往會引起較為嚴重的不良反應[24]。本研究設計的PD-1/ICOS信號轉換受體使得回輸的CAR-T細胞在腫瘤局部解除PD-1/PD-L1的抑制作用，有效減小全身的副反應。

先前的研究表明，ICOS共刺激受體被證明可以增強CD8+T細胞介導的抗腫瘤活性[25]。此外，基于ICOS作為共刺激信號的CAR受體增強了CD8+T細胞的細胞因子釋放和體內持久性[26]。本研究設計的PD-1/ICOS信號轉換受體將腫瘤微環境中的PD-1信號轉換為ICOS信號，證明的確可以增強CAR-T細胞的增殖活性。

CAR-T細胞應用于臨床治療時應該平衡療效和毒性。然而，由于缺乏良好的動物模型，限制了對PD-1/ICOS-bbz毒性的評價[27]。盡管如此，我們可以在后續的研究中為PD-1/ICOS-bbz額外設計一些安全開關，使其即使發生不良反應，也可以及時采取相應手段予以控制[28]。

4 結論

本研究證實了通過逆轉腫瘤來源的抑制信號來增強CAR-T細胞的抗腫瘤活性的可行性。嵌合受體(PD-1/ICOS)與腫瘤細胞上的PD-L1結合，并激活ICOS受體相關的下游信號級聯，增強CAR-T細胞的增殖能力及體內的抗腫瘤活性。該研究為DLBCL的治療提供了一種潛在的方案，有望在不遠的未來進行臨床研究進一步探索其治療效果。