益腦通絡顆粒對小鼠出凝血時間和大鼠凝血四項以及血細胞的影響

烏凱迪，張婷婷，宋瑩，王振，李曉瑩，周明博，陳陽燕，蔣希成

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

凝血系統由細胞和可溶性蛋白質組成，正常人體的生理性凝血是在身體血管損傷部位的止血過程。而血栓形成是指人體過度凝血進而導致不良心腦血管事件的過程，如心肌梗死、中風和靜脈血栓栓塞等。

益腦通絡顆粒是經名老中醫陳景河所擬的“中風防治片”深入研究并更換劑型所創，全方由益母草、何首烏、葛根、川芎、杜仲、紅花、澤瀉7味藥組成，具有活血化瘀、祛風通絡、益精填髓等功效。本課題組對自擬方益腦通絡顆粒進行臨床前研究，在“上工治未病”和“未病先防、既病防變”的思想下，對健康大鼠和小鼠進行實驗研究，觀察凝血四項以及紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)以及紅細胞壓積(HCT)指標，以此判斷益腦通絡顆粒對于現實生活中部分人群存在的危險致病因素的調控作用，為后續的實驗打好基礎，同時旨在發現該藥物對于凝血功能異常的預防作用，從而降低由凝血功能異常導致中風發病的風險。

1 材料

1.1 儀器和試藥

電子天平(上海光正醫療儀器有限公司)；注射器、剪刀、秒表、玻璃毛細管(江蘇省長豐醫療實業有限公司)；全自動血凝儀(北京普利生儀器有限公司，型號：C2000-A)；多用臺式高速冷凍離心機(美國貝克曼公司，型號：X-22R)；益腦通絡顆粒水溶液(方中各藥均購自于哈藥集團世一堂中藥飲片有限公司)。

1.2 實驗動物

ICR雄性小鼠40只，體質量18～22 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001。SD雄性大鼠20只，體質量220～240 g，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(黑)2018-003，動物飼養室溫度21～25 ℃，相對濕度60%～70%，每天光照12 h，自由攝食、攝水。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥

將ICR雄性小鼠隨機分為4組，分別是空白對照組、益腦通絡顆粒低劑量組(9 g/kg生藥)、益腦通絡顆粒中劑量組(18 g/kg生藥)、益腦通絡顆粒高劑量組(36 g/kg生藥)，每組5只，每天灌胃1次，每次0.4 mL，空白對照組給予等量蒸餾水，連續給藥7 d。

將SD雄性大鼠隨機分為4組，分別為空白對照組、益腦通絡顆粒低劑量組(6 g/kg生藥)、益腦通絡顆粒中劑量組(12 g/kg生藥)、益腦通絡顆粒高劑量組(24 g/kg生藥)，每組5只，每天灌胃1次，每次2 mL，空白對照組給予等量蒸餾水，連續給藥7 d。

2.2 益腦通絡顆粒對小鼠出血時間的影響

每組取小鼠5只，于末次給藥后1 h，在正常飼養溫度下，用剪刀在距離鼠尾約3 mm處剪去小鼠尾巴，血液自行流出后開始計時，每隔10 s用濾紙輕拭血滴1次，直至拭后不再出血為止，停止計時，所記錄時間為出血時間[2]。

2.3 益腦通絡顆粒對小鼠凝血時間的影響

每組取小鼠5只，于末次給藥后1 h，在正常飼養溫度下，用玻璃毛細管插入小鼠眼內眥球后靜脈叢，從血液流入玻璃毛細管開始計時，至血液充滿整個毛細管為止，取出玻璃毛細管，平放在實驗臺上，每隔10 s折斷玻璃毛細管5 mm，并緩慢左右拉開，觀察折斷面是否有血凝絲出現，重復多次，直至有血凝絲出現，立刻停止計時，所記錄時間為凝血時間[3]。

2.4 益腦通絡顆粒對大鼠凝血四項的影響

每組取大鼠5只，于末次給藥后1 h，將其麻醉，用檸檬酸鈉(9∶1)真空采血管腹主動脈取血2 mL，放入離心機中，3 000 r/min，離心10 min，分離血漿，用全自動血凝儀測定凝血四項(APTT、PT、TT、FIB)[4]指標。

2.5 益腦通絡顆粒對大鼠血細胞分析的影響

每組取大鼠5只，于末次給藥后1 h，將其麻醉，用檸檬酸鈉(9∶1)真空采血管腹主動脈取血2 mL，用全血自動分析儀測定各組大鼠紅細胞、血紅蛋白以及紅細胞壓積[5]。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 益腦通絡顆粒對小鼠出血時間的影響

小鼠灌胃7 d，與空白對照組比較，益腦通絡顆粒低、中、高劑量組均可以顯著延長小鼠出血時間(P<0.01)，見表1。

表1 益腦通絡顆粒對小鼠出血時間的影響

3.2 益腦通絡顆粒對小鼠凝血時間的影響

小鼠灌胃7 d，與空白對照組比較，益腦通絡顆粒低、中、高劑量組均可以顯著延長小鼠凝血時間(P<0.01)，但益腦通絡顆粒中、高劑量組之間差異無統計學意義(P>0.05)，結果見表2。

表2 益腦通絡顆粒對小鼠凝血時間的影響

3.3 益腦通絡顆粒對大鼠凝血四項的影響

大鼠灌胃7 d進行凝血四項實驗，結果顯示，與空白對照組相比較，針對于APTT，益腦通絡顆粒低劑量和中劑量組存在顯著差異(P<0.01)；而高劑量組并無顯著差異(P>0.05)；在PT方面，低劑量組無顯著差異(P>0.05)，但中、高劑量組表現出極顯著的差異性(P<0.01)；在TT的數據上，只有中劑量組存在了顯著的差異性(P<0.05)，其他兩組差異均無統計學意義(P>0.05)；在FIB中，低劑量組存在顯著差異(P<0.05)，中劑量組和高劑量組具有極顯著的差異性(P<0.01)。以上實驗結果說明了益腦通絡顆粒具有延長APTT、PT以及TT的作用，且可以降低血液中FIB，從而發揮抗凝血的作用，結果見表3。

表3 益腦通絡顆粒對大鼠APTT、PT、TT、FIB的影響

3.4 益腦通絡顆粒對大鼠血細胞的影響

經過對灌胃后的大鼠取腹主動脈血，進行紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)分析。與空白對照組相比，在RBC方面，益腦通絡顆粒低劑量組和中劑量均無顯著差異(P>0.05)，而高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)；在HGB方面，低劑量組和中劑量組雖然在平均水平上可以看出有些變化，但兩組差異均無統計學意義(P>0.05)，高劑量組存在顯著的差異性(P<0.05)；在HCT數據上，只有高劑量組表現出極顯著的差異性(P<0.01)，結果見表4。

表4 益腦通絡顆粒對大鼠血細胞的影響

4 討論

針對于凝血功能的重要性，在臨床上醫生常常以凝血功能檢測結果對患者進行病情評估，凝血四項是臨床上常見評價凝血功能的檢測之一，凝血功能異常常常會導致瘀血。通過對小鼠出血時間和凝血時間的研究發現，益腦通絡顆粒可以有效地延長出、凝血時間，具有顯著的活血效果。其中，研究人員通過對益母草提取物進行抗血小板聚集實驗，顯示該藥物對花生四烯酸和二磷酸腺苷誘導兔的血小板聚集具有潛在的抗聚集作用，對TNF-α的表達有抑制作用[6]。方中所用葛根具有擴張血管、抑制血小板聚集的作用，能夠防止動脈粥樣硬化[7]。而紅花在《新修本草》中記載：“紅花治口噤不能語, 血結及產后諸病。”其功效為活血通經、散瘀止痛[8]。有研究表明，紅花的有效成分可以明顯延長凝血時間，抑制血小板聚集，同樣降低了血栓形成的風險，對于預防中風起到了促進作用[9]。CAI等[10]通過研究顯示川芎嗪可顯著降低大鼠全血黏度和血小板聚集性，此外，李力[11]通過川芎嗪對血小板進行體外實驗，表明了川芎嗪具有顯著抑制ADP誘導的血小板聚集的能力。這兩個實驗均表明，川芎也具備抗血小板聚集作用，降低血栓發生概率的功效。

相關資料顯示，中風患者不同凝血指標的改變或早于影像學上的改變，這些指標的改變可進一步激活凝血系統，引起抗凝、凝血、纖溶水平變化[12]。而凝血四項是展現凝血功能的主要指標，其中APTT和PT分別反映內源性凝血系統和外源性凝血系統的狀況；FIB是體內參與凝血的一個重要因子，其水平升高代表著血液可能屬于高凝狀態；TT主要反映FIB轉為纖維蛋白的時間[13]。

本實驗中，通過對正常大鼠凝血四項的檢測發現，益腦通絡顆粒可以明顯延長大鼠的APTT、PT以及TT，表明益腦通絡顆粒能同時抑制內源性和外源性凝血因子的活性，具有抗凝血的作用；對于FIB，益腦通絡顆粒也能使其呈現明顯的下降趨勢，同樣起到了抗凝血作用。實驗結果顯示，益腦通絡顆粒中劑量組在各項指標上與空白對照組比較均呈顯著差異，為臨床用藥量提供了新思路。有研究表明紅細胞數值的異常增多，可能伴隨著血紅蛋白、紅細胞壓積、血小板增多，進一步造成頭暈、頭脹等癥狀，嚴重的可能會引起心肌梗塞、腦血栓等血栓類疾病[14]。血紅蛋白數目的異常增多，會導致人體血液黏稠度上升，血管類疾病的風險也會大大增加[15]。本文探討了益腦通絡顆粒對于血細胞中的紅細胞等數據的影響，通過與空白對照組相比，益腦通絡顆粒高劑量組別展現出較好的降低紅細胞、血紅蛋白以及紅細胞壓積的能力，對于預防凝血功能異常起到了積極的作用。

綜上所述，益腦通絡顆粒具有較好的抗凝血功能，活血化瘀功效較為顯著，同時為預防由凝血異常引起的相關疾病提供了可能。