基于β-catenin介導金郁歡抗抑郁的初步研究

劉宏，黃楊，張雨薇，仲麗麗，代巧妹，楊婧，倪雪妍，李冀

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥是一種常見的精神疾病，也是全世界殘疾的主要原因之一[1]，其主要臨床表現為顯著而持久的心境低落、思維遲緩、認知功能損害[2]以及自我毫無價值感和反復出現的自殺念頭、食欲和體質量顯著變化(增加或減少)等[3]。對于中醫而言，抑郁癥屬于“郁證”的統籌范圍。近年來中藥因其多成分、多環節、多靶點和毒副作用小的優勢成為抗抑郁藥物研究中的熱點領域[4]。根據中醫對抑郁癥的病機認識，本實驗通過慢性輕度不可預知應激加孤養(CMUS)方法建立大鼠抑郁模型，采用中藥復方金郁歡為干預方藥，選用在臨床上應用多年并取得滿意治療效果的烏腺金絲桃和郁金、合歡花水提取物[5]進行配伍應用，以β-catenin信號通路為切入點，觀察金郁歡對小鼠海馬組織損傷修復和β-catenin蛋白的影響,從而初步探索金郁歡治療抑郁癥的作用及其機制。

1 材料

1.1 動物

清潔級ICR小鼠60只，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，動物生產許可證：SCXK(黑)2018-003。小鼠體質量(20±2)g，鼠齡8～10周，雌雄不限，正常晝夜節律條件，溫度18～25 ℃，濕度55%～65%，自由進食和飲水。

1.2 藥物與試劑

金郁歡湯劑，藥物組成為烏腺金絲桃30 g，郁金15 g，合歡花15 g，(購自北京同仁堂藥店，鑒定為正品)。另取單味藥烏腺金絲桃60 g，單味藥郁金30 g，單味藥合歡花30 g，烏腺金絲桃與郁金、合歡花配伍比例為2∶1∶1。提取時，用水浸泡藥材2 h，10倍量的水進行提取后濃縮至所需體積。

鹽酸氟西汀(百憂解)(禮來制藥公司，美國)。在0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液中溶解成混合懸浮液。

Rabbit Anti-β-catenin(北京博奧森，貨號bs-23663R，lot：BA01048540)；蛋白酶抑制劑(Roche, Indianapolis, IN, USA)；Super-GL ECL 超敏發光液(艾博思生物)；Lowry蛋白測定試劑盒(Meiji Biotech,中國上海有限公司)；RT試劑盒(Novland公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；TAE緩沖液、瓊脂糖等。

1.3 主要儀器

曠場實驗裝置：一個底部方形(60 cm×60 cm×20 cm)的開箱，自制；NIKON顯微鏡(ECLIPSE-50I，日本)；輪轉式切片機(R138，湖北泰維科技實業有限公司)；JD-801形態學圖像分析系統(捷達公司，南京)；Power PacTMHC電泳儀(bio-rad)；VE-180垂直電泳槽(天能)；DY-B1脫色搖床(上海青浦滬西儀器)等。

2 方法

2.1 動物分組及模型的建立

將60只ICR小鼠隨機分為5組：control組(Control)、model組(Model)、金郁歡(低、高)劑量組(JYH-L、JYH-H)、fluoxetine組(Fluoxetine)，每組12只。采用CMUS法，每天使用不一樣的刺激方法建立小鼠抑郁模型，采取了7種刺激方法，每天隨機選擇1種刺激，且刺激的方法不同，保持一段時間不間斷。具體刺激方法如下：(1)潮濕鼠籠，24 h;(2)固定小鼠，時間2 h;(3)在冰水(4 ℃)中游泳，時間3 min;(4)電擊小鼠足部，10 s;(5)在熱水中游泳，時間3 min;(6)夾尾，時間2 min;(7)禁水，時間24 h;(8)歪斜小鼠籠，時間24 h;(9)絕食，時間24 h。

2.2 給藥途徑及劑量

JYH-L、JYH-H組分別給予金郁歡提取物0.2 g/kg、0.8 g/kg；fluoxetine組以0.02 g/(kg·d)劑量給予氟西汀懸浮液灌胃。control組和model組小鼠灌胃等體積生理鹽水。以上各組小鼠每日給藥1次，連續給藥3周后進行行為學實驗。

2.3 樣本制備

行為學測試后，每組6只大鼠深度麻醉后灌入400 mL生理鹽水、1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，然后用500 mL 4%多聚甲醛溶液固定，pH 7.4。腦組織在視神經交叉后4 mm處，即海馬平面做冠狀切片(1.5 cm×1 cm×5 cm)。組織塊4 ℃低溫固定48 h。腦組織用石蠟包埋并切片至所需的厚度(5 mm)。

2.4 曠場實驗(OFT)

將一個方形底部(60 cm×60 cm×20 cm)的開箱，分成36個大小相等的網格。用酒精去除實驗空間的氣味后，將小鼠放置在每個象限的中心。記錄各組小鼠5 min內在箱中水平移動得分(后腿跨越方格數)和直立得分(前肢站立次數)以測量探索行為。

2.5 Nissl染色觀察海馬神經元形態

將切片浸入1%甲苯胺藍溶液中染色,50 ℃ 20 min，用蒸餾水快速沖洗并分化。用蘇木精復染色，脫水后，清洗并安裝載玻片。

每只小鼠腦組織1張切片，每張切片選取10個不重疊連續高倍(×400)視野觀察，JD-801形態學圖像分析系統分析各組小鼠海馬CA3區尼氏小體總面積(S總)。

2.6 免疫組織化學法及Western blot法檢測β-catenin蛋白水平

將組織塊進行梯度酒精逐級脫水(70%→80%→95%→100%)，從低濃度向高濃度脫水(各1～2 h)，二甲苯透明20～30 min，DAB顯色，蘇木素復染。

將海馬組織加RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，離心收取總蛋白，電泳，加入增強化學發光(ECL)液計算蛋白含量。

2.7 RT-PCR法檢測β-catenin基因表達水平

采用Trizol-A+試劑提取各組小鼠缺血側腦皮質半暗帶區總RNA，用小鼠莫洛尼白血病病毒逆轉錄酶從RNA中合成cDNA，紫外線下電泳。

2.8 統計學分析

本研究的數據以平均數±標準差表示。使用統計軟件SPSS19.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行數據處理。組間比較采用方差分析。在方差齊性的情況下采用Bonferroni’s方法進行兩兩比較，在方差不齊的情況下采用Welch’s方法進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 曠場實驗

與control組比較，model組水平移動得分無明顯差別(P>0.05)；與model組比較，JYH-L組、JYH-H組、fluoxetine組水平移動得分無明顯差別(P>0.05)。與control組比較，model組直立得分降低(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組直立得分無顯著差別(P>0.05)，JYH-H組、fluoxetine組直立得分顯著增加(P<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠探索行為得分比較

3.2 金郁歡對CMUS小鼠海馬CA3區神經元細胞尼氏小體S總的影響

定量分析顯示，與control組比較，model組S總顯著降低(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組、JYH-H組上述指標增高(P<0.05，P<0.01)，fluoxetine組上述指標亦表現為增高(P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠海馬CA3區尼氏小體總面積比較

3.3 免疫組織化學法檢測β-catenin蛋白表達結果

光鏡下觀察到，β-catenin陽性細胞主要分布于皮質及海馬區。DAB染色顯示，棕黃色顆粒出現在β-catenin陽性細胞的細胞漿，control組切片著色非常淺或不著色，見圖1。測定各組小鼠海馬陽性細胞β-catenin的IOD，IOD值大小代表蛋白陽性表達量的多少。測定結果顯示，與control組比較，model組 β-catenin 表達下降(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組β-catenin表達升高(P<0.05)，JYH-H組β-catenin 表達顯著升高(P<0.01)，fluoxetine組β-catenin表達顯著升高(P<0.01),見表3、圖1。

表3 各組小鼠海馬β-catenin表達情況

圖1 各組小鼠海馬β-catenin表達(DAB染色,10×20)

3.4 Western blot法檢測β-catenin蛋白表達結果

結果分析顯示，與control組比較，model組小鼠海馬β-catenin蛋白含量明顯降低(P<0.01)，與model組比較，JYH-L組、JYH-H組海馬β-catenin含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，fluoxetine組海馬β-catenin含量明顯升高(P<0.01)，見表4。

表4 各組小鼠海馬β-catenin蛋白表達比較

3.5 RT-PCR法檢測β-catenin mRNA表達結果

結果顯示，與control組比較，model組小鼠海馬β-catenin mRNA表達降低(P<0.01)；與model組比較，JYH-L組、JYH-H組小鼠β-catenin mRNA表達均明顯升高(P<0.01)，fluoxetine組提示小鼠β-catenin mRNA表達亦明顯升高(P<0.01)，見表5。

表5 各組小鼠海馬β-catenin mRNA表達比較

4 討論

抑郁癥是一種復雜而又發作頻繁的疾病，相關研究表明與抑郁癥相關的健康狀況比其他慢性疾病有明顯的衰退[6]。隨著時代的發展，研究者越來越關注抑郁癥發展機制。然而其發病機制相當復雜，涉及到遺傳、應激、單胺類物質缺乏、下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)失調、免疫、內分泌和神經發生等多種因素[7-8]，但其中最經典的莫過于Wnt/β-catenin學說[9]。進化保存的Wnt/β-catenin通路啟動信號級聯，在正常胚胎發育期間和每個組織器官系統有機體的整個生命中都至關重要。在中樞神經系統內，Wnt信號級聯協調神經元功能的所有方面，包括分化，突觸形成和可塑性、神經生成和再生[10-11]。相關研究[12]表明抑郁行為與海馬組織Wnt信號通路功能紊亂有關，在wnt通路中一個很重要的因子就是β-catenin，它負責將核外應激信號傳遞到核內，由此可見β-catenin的表達讓整個Wnt信號通路的生物學效應受到了影響。許多研究表明，β-catenin信號與抑郁癥的病理生理學和治療有牽連[13-14]。YANG等[15]學者研究發現，通過RES治療提高了神經營養因子的海馬蛋白水平以及p-β-catenin/β-catenin的相對比率，通過降低HPA軸多動性、增加BDNF表達和等離子IL-6、CRP和TNF-α濃度以及調節海馬Wnt/β-catenin通路，改善了CUMS大鼠的抑郁行為。QIN等[16]學者通過EA治療降低了β-catenin的mRNA和蛋白表達水平。隨著β-catenin表達水平逐漸降低，顯示Wnt信號通路正逐漸從激活狀態向抑制過程移動。β-catenin的表達顯示出抗抑郁作用，表明EA可以通過Wnt/β-catenin信號通路刺激神經生成，保護海馬神經元免受抑郁大鼠的傷害，并在一定程度上產生抗抑郁作用。

近年來，中醫藥在抗抑郁方面發揮了重要作用，單獨應用中藥或中西藥聯合應用顯示出快速抗抑郁作用[17-18]。中醫將抑郁癥歸于“郁病”的范疇。目前主流觀點認為抑郁癥的病機是肝氣郁滯、脾氣郁結。正由于身體內部的氣機不暢，使得疾病進一步發展從而由氣及血，最后導致臟腑功能失調，氣血陰陽紊亂[19]，加重了病情，所以治療上應疏肝健脾。通過篩選發現，中藥合歡花具有解郁安神之功效。施學麗等[20]學者發現合歡花可以增加大鼠海馬區神經元細胞數量，這使得大鼠海馬神經元得到了有效的修復，改善了大鼠的抑郁行為。郁金有行氣解郁，清心涼血之功效，有研究指出郁金中的有效成分谷甾醇在抑郁癥發作過程中可以通過調節多巴胺、五羥色胺受體等，對抑郁癥產生的焦慮行為起到一定的緩解作用[21]。烏腺金絲桃經李冀等[22]學者實驗研究發現其具有抗抑郁、鎮痛、抗菌、抗炎等作用。本研究將通過此3者搭配而成的金郁歡湯劑，研究其對小鼠抑郁行為的調節是否有作用。本實驗通過不可預見慢性刺激的方法復制抑郁動物模型，觀察金郁歡對模型動物行為學、海馬組織內神經元細胞形態和海馬CA3區尼氏小體總面積(S總)以及分子β-catenin蛋白的影響。

本研究發現，在曠場實驗中，與模型組對比，金郁歡高、低劑量組小鼠的水平得分不是特別明顯，這可能與實驗誤差有關，在日后實驗中需特別注意此類問題，實驗前應去除房間有可能刺激小鼠的氣味。與對照組相比，模型組小鼠直立得分降低，與模型組比較，金郁歡組直立得分升高，說明藥物治療在一定程度上改善了抑郁造成的快感缺失[23]，增強了小鼠活動的積極性。

有相關研究表明藥物的定期日常治療可以有效地改善接受CUMS程序的小鼠的行為改變[24]。慢性應激還會引起神經細胞形態改變，降低細胞內腦源性神經營養因子水平，從而導致抑郁癥發生[25]。Nissl染色也顯示，與模型組比較，JYH-H組與fluoxetine組海馬組織中神經元細胞面積范圍更大，尼氏小體總面積有所增高。尼氏小體面積的增大可以看出金郁歡對海馬神經元的保護起到了一定的作用，修復了部分受損神經元。這與有關研究的結果具有一致性[26]。因此可以假設，外界的應激影響了Wnt/β-catenin信號通路，這使得神經系統的活性受到了影響，然后改變了海馬區的神經功能，從而導致小鼠產生不同程度的抑郁和焦慮樣行為。但JYH-L組的尼氏小體變化不大，提示我們需要注意金郁歡復方劑量的問題，低劑量的金郁歡對小鼠腦組織結構的影響不是特別明顯，免疫組織化學檢測和Western Blot法中也顯示，與模型組對比，JYH-H組與fluoxetine組β-catenin表達顯著升高(P<0.01)。利用RT-PCR法檢測β-catenin mRNA表達的結果也同樣顯示出，與model組比較，其余3組用藥組β-cateninmRNA表達均明顯升高。LI等[27]人的研究中發現，在Wnt信號出現后，β-catenin表達水平顯著升高，這與本實驗結果也是符合的。本研究表明金郁歡抗抑郁的作用可能與β-catenin上調有關，影響了β-catenin蛋白表達水平，從而影響抑郁癥的發生發展，這也為臨床用藥提供了一個新的思路。

總之，金郁歡復方的應用可以提高抑郁性失眠動物自主活動和主動探索陌生環境的能力，使得抑郁小鼠腦內海馬組織形態及功能得到了明顯改善，保護了海馬神經元細胞，提高腦內β-catenin蛋白的表達水平，從而發揮改善抑郁行為功效的能力。這為臨床治療抑郁癥提供了有效的實驗數據。但典型的Wnt/β-catenin信號通路在神經系統疾病中的變化存在復雜性，Wnt信號的失活(下調)導致β-連環蛋白降解并促進神經發生多種疾病[28-29]，抑郁癥發病機制是復雜多變的，樣本數據量的多少以及氣候環境等因素的不可控性，金郁歡的藥材產地以及藥量多少和配伍比例也需要進一步明確，其抗抑郁的作用機制仍待進一步研究。