基于UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)的東北黃精、多花黃精及滇黃精成分分析

楊波，黃金月，鄭時嘉，唐檬，馬鷹，夏念桐，于純淼，王志剛*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天問山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150300)

黃精(Polygonatirhizoma)收錄于2020年版《中華人民共和國藥典》一部，為百合科黃精(Polygonatumsibiricum)、多花黃精(Polygonatumcyrtonema)及滇黃精(Polygonatumkingianum)的干燥根莖[1]，兼具藥用、食療、外敷[2]、觀賞[3]等功效價值，收載于最新版《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)目錄》中[4]。黃精多糖、皂苷、蒽醌、黃酮及氨基酸等多種有效成分，具有補氣、養(yǎng)陰、止饑、除風濕、耐寒暑、抗衰老、抗炎抗菌、增強免疫力等活性[5-6]，可用于預防或治療阿爾茲海默病、糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化等病癥[7-8]。黃精亦是傳統(tǒng)中藥材，分布于關(guān)藥、北藥、南藥、云藥及貴藥，其中關(guān)藥指東北地區(qū)，主要分布于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古；北藥指華北地區(qū)，主要分布于山西、河北，盛產(chǎn)黃精；南藥指長江以南，南嶺以北地區(qū)，主要分布于江西、湖南，盛產(chǎn)多花黃精；云藥指云南省，貴藥指貴州省，盛產(chǎn)滇黃精[9]。隨著黃精繁殖培育勢頭正盛，黃精保健茶、沖調(diào)食品和即食食品等保健品系列也紛紛興起，各產(chǎn)地黃精質(zhì)量良莠不齊，黃精的化學成分分析及相應(yīng)的質(zhì)量控制方法制訂至關(guān)重要。

黃精中所含化學成分是衡量各產(chǎn)地黃精質(zhì)量標準的重要指標，目前關(guān)于各產(chǎn)地黃精成分分析的研究主要有高效液相檢測、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等，但針對藥典中3種基源黃精的全成分分析卻未見報道[10]。超高效液相色譜與四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q/TOF-MS)因靈敏度高、檢測速度快等絕對優(yōu)勢，成為近年來復雜基質(zhì)全成分分析的最有效方法之一。本研究以超聲波輔助提取法對黃精干燥根莖進行樣品前處理，以UPLC-Q/TOF-MS對黃精、多花黃精及滇黃精進行全成分分析，為進一步制訂黃精質(zhì)量標準、促進黃精資源開發(fā)和藥食兩用提供參考[11]。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜(Waters AcquityTM UPLC)-質(zhì)譜(Waters SynaptTMG2-Si MS)聯(lián)用儀(美國沃特世科技有限公司)；Masslynx V4.1工作站(美國沃特世科技有限公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Thermo Scientific Finnpipette F3單通道移液器(規(guī)格20～200 μL,美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試劑和藥材

分析純甲醇(天津市富宇精細化工有限公司)；色譜級乙腈(德國Merck技術(shù)有限公司)；亮氨酸腦啡肽(美國SIGMA技術(shù)有限公司)；黃精生藥材(批號：20210813，天問山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司)；多花黃精生藥材(批號：20210811，湖南天地農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司)；滇黃精生藥材(批號：20210723，四川福曦堂生物科技有限公司)。黃精生藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院孫慧峰教授鑒定為黃精、多花黃精及滇黃精。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

黃精根莖除須根，洗凈，切片，置60 ℃烘箱中干燥[12]。取干燥后的黃精切小塊，粉碎，過4號(60目)篩，稱取粉末2 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇[13]20 mL，稱重，超聲提取40 min，提取2次，放冷至室溫，稱重，補足失重80%甲醇，過濾，合并2次濾液，蒸干，浸膏用少量甲醇復溶[14]，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻線，置4 ℃冰箱中冷藏備用。臨用前，過0.22 μm微孔濾膜至進樣杯中，供UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3(1.8 μm 2.1 mm×100 mm Column)；流動相 A：0.1%甲酸-乙腈，B：0.1%甲酸-水，梯度洗脫(0～5 min，10%～25%A；5～10 min，25%～50%A；10～20 min，50%～85%A；20～30 min，85%～100%A)；色譜柱溫度：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL[15]。

2.2.2 質(zhì)譜條件

采用全掃描和全信息串聯(lián)質(zhì)譜(MSE)模式掃描，電噴霧(ESI)離子源，以centriod模式分別在正、負離子模式下采集數(shù)據(jù)，并采用美國Waters集團公司獨家專利Lockspray校正系統(tǒng)進行在線亮氨酸-腦啡肽(Leueine-enkephalin，[M+H]+=556.277 1；[M-H]-=554.277 1)質(zhì)量校正，溶液濃度為1 ng/μL，流速為10 μL/min，掃描范圍：50～1200 Da。本實驗中正、負離子模式下的質(zhì)譜具體參數(shù)設(shè)置值：錐孔電壓40 v；毛細管電壓3 kv；離子源溫度210 ℃；脫溶劑氣流量600 L/h；錐孔氣體流量50 L/h。

2.3 供試品溶液的UPLC-Q/TOF-MS分析

取“2.1”項下供試液，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件檢測。

2.4 數(shù)據(jù)收集與處理

MSE數(shù)據(jù)首先通過MassLynx V4.1工作站進行色譜峰的初步提取和預處理，然后利用MassLynx中的“Elemental Composition”工具獲取質(zhì)譜信息，并查詢Chemspider、Pubchem、TCMSP、HMDB、KEGG、MassBank等數(shù)據(jù)庫。在此僅以PubChem數(shù)據(jù)庫舉例說明，通過MassLynx V4.1工作站獲取初步的分子式、分子質(zhì)量、誤差(ppm)和碎片離子等質(zhì)譜信息，選擇ppm值最小的分子式，進入Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過比對二級質(zhì)譜碎片離子相關(guān)信息選取最符合的化合物。再結(jié)合 PubMed、CNKI等網(wǎng)站，參考中英文相關(guān)文獻，建立黃精化合物數(shù)據(jù)庫，再次根據(jù)碎片離子信息與數(shù)據(jù)庫進行比對，進行化學成分的初步鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 UPLC色譜分析

黃精藥材中成分種類眾多，若提取方法或試劑選取不恰當，可能會造成某類成分嚴重缺失。目前提取方法多為超聲波提取法、水浴回流法，水提取等，經(jīng)前期驗證，水提取法提取成分較單一，多為多糖類，且水溶液易霉變不易保存；水浴回流法費時費力，最終確定以超聲提取法作為供試品溶液制備方法。提取溶劑多為乙醇、甲醇等，經(jīng)查閱文獻，乙醇提取主要成分為皂苷、黃酮類，不具有全面性。本研究用甲醇作為提取溶劑，結(jié)合超聲波法對3種黃精全成分進行有效提取，再采用UPLC/MS對其全成分進行表征。東北黃精、多花黃精及滇黃精色譜圖見圖1～圖3。

注：A.正離子模式色譜圖；B.負離子模式色譜圖。

注：A.正離子模式色譜圖；B.負離子模式色譜圖。

注：A.正離子模式色譜圖；B.負離子模式色譜圖。

由圖1、2、3可知，3種黃精中的大量成分得到表征，且主要色譜峰分離較好，對比各圖，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地3種黃精化學成分差異存在差異，其中檢測到的色譜峰數(shù)，東北黃精最多、多花黃精次之、滇黃精最少。

3.2 MS分析

按上述方法采集的MSE數(shù)據(jù)，獲取二級質(zhì)譜碎片離子信息，與相關(guān)中英文文獻[2-16]資料比對，對“3.1”項下各色譜峰進行結(jié)構(gòu)鑒定。并以黃精中41號色譜峰為例，說明分析步驟。圖4為41號峰的一級、二級質(zhì)譜圖，在一級質(zhì)譜圖中，m/z 1107的峰是準分子離子([M-H]-)峰，結(jié)合“Elemental Composition”數(shù)據(jù)處理及PubChem、MassBank、KEGG等網(wǎng)站查詢，基本確定該化合物為三萜皂苷類的人參皂苷Rb1，檢測到m/z 945，783，621，459的碎片峰，圖5為人參皂苷Rb1最可能的裂解途徑。

注：A.一級質(zhì)譜圖；B.二級質(zhì)譜圖。

圖5 黃精41號峰推測的質(zhì)譜裂解途徑

在30 min內(nèi)，東北黃精檢測到57個化合物，負離子模式下鑒定了55個化合物，正離子模式下鑒定了33個化合物。其中包括17個甾體皂苷類成分，14個黃酮類成分，5個三萜皂苷類成分，3個多糖及苷類成分，3個甾醇類成分，2個氨基酸類成分，2個生物堿類成分，1個香豆素類成分；多花黃精檢測到42個化合物，正離子模式下鑒定了34個化合物，負離子模式下鑒定了26個化合物。其中包括15個黃酮類成分，8個甾體皂苷類成分，4個多糖及苷類成分，3個三萜皂苷類成分，3個氨基酸類成分，2個甾醇類成分，1個生物堿類成分，6個其他；滇黃精檢測到30個化合物，正離子模式下鑒定了23個化合物，負離子模式下鑒定了18個化合物。其中包括11個黃酮類成分，6個甾體皂苷類成分，4個多糖及苷類成分，3個三萜皂苷類成分，2個生物堿類成分，1個氨基酸類成分，1個羧酸類成分，1個內(nèi)源性核苷類成分，1個其他。3種黃精的質(zhì)譜及鑒定結(jié)果見表1～表3。

表1 東北黃精化學成分的質(zhì)譜信息

表2 多花黃精化學成分的質(zhì)譜信息

4 討論

本實驗采用超聲波提取法以甲醇提取3種黃精藥材，采用UPLC/MS表征分析樣品所含化學成分，結(jié)果表明，3種黃精所含化學成分差異明顯，所建立的方法可用于區(qū)分3種黃精。此前已報道的黃精主要成分分析方法存在檢測成分少，檢測方法不完善等諸多問題。余亞鳴等[17]采用HPLC-MS法檢測了單一黃精中的化學成分，黃精品種少且方法靈敏度低；楊興鑫等[18]利用多元統(tǒng)計分析檢測3種基源黃精中化學成分，比較了3種黃精化學成分差異性，但未對化學成分進行結(jié)構(gòu)鑒定。前期本課題組測定的東北黃精中總皂苷、總黃酮含量多于多花黃精及滇黃精[19]，此次研究發(fā)現(xiàn)東北黃精中化學成分種類也明顯多于多花黃精及滇黃精，多成分含量及種類體現(xiàn)出了東北黃精的質(zhì)量優(yōu)越性，本研究為東北黃精道地藥材資源和保健食品開發(fā)提供重要參考。