魯中肉羊FecB基因多態性與體尺性狀的關聯分析

張亞男,汪浩源,王舒君,張明珠,紀志賓,5*,李慶,杜善峰,晁天樂,王建民,王勇,亓寶華,薛海鵬,李強,張民,潘林香,田洪福,韓合國,孟憲雨,張彤晨

魯中肉羊基因多態性與體尺性狀的關聯分析

張亞男1,汪浩源1,王舒君1,張明珠1,紀志賓1,5*,李慶1,杜善峰1,晁天樂1,王建民1,王勇2,亓寶華2,薛海鵬2,李強2,張民3,潘林香4,田洪福4,韓合國6,孟憲雨6,張彤晨6

1. 山東農業大學動物科技學院, 山東 泰安 271018 2. 濟南市畜牧技術推廣站, 山東 濟南 250300 3. 濟南市農業科學研究院畜牧漁業科創部, 山東 濟南 250300 4. 山東嬴泰農牧科技有限公司, 山東 濟南 271100 5. 黃河口灘羊產業研究院, 山東 利津 257400 6. 利津縣現代畜牧業發展服務中心, 山東 利津 257400

本研究旨在分析基因g.746A>G位點多態性對魯中肉羊生長性狀的影響。以240只6月齡魯中肉羊母羊為研究對象，通過一代測序技術和瓊脂糖凝膠電泳對魯中肉羊基因該位點進行多態性檢測，采用單因素方差分析不同基因型與魯中肉羊生長性狀的關系。結果表明，基因g.746A>G位點存在3種基因型，BB、B+和++，且B+為優勢等位基因型，B為優勢等位基因。遺傳參數分析結果表明，基因g.746A>G位點的雜合度是0.498，純和度是0.502，有效等位基因數是1.992，多態信息含量是0.374，表現為中度多態性(0.25G位點BB基因型的體高顯著低于B+和++基因型（<0.05）；BB基因型的胸圍和腹圍顯著低于++基因型（<0.05），極顯著低于B+基因型（<0.01）；該位點三種基因型的體長、管圍、尻寬、尻長、胸深、胸寬、腰角寬、坐骨端寬均無顯著差異（>0.05)。綜上所述，基因突變位點對魯中肉羊生長性狀有一定程度的影響，本研究可為基因在魯中肉羊的分子標記輔助育種提供理論參考依據。

魯中肉羊;基因; 多態性; 生長性狀; 關聯分析

魯中肉羊是由山東贏泰農牧科技有限公司聯合山東農業大學、中國農業科學院、山東省農業科學院等單位，利用肉用性能好的南非杜泊綿羊[1]作為父本，繁殖率高的湖羊[2,3]作為母本，采用常規育種和分子遺傳標記輔助選擇技術，經雜交改良、橫交固定、繼代選育與擴繁，歷經15年（2004-2019）培育出適合生產優質高檔羊肉的專門肉用綿羊新品種[4]，在2020年12月31日，獲魯中肉羊新品種證書。魯中肉羊具有早熟、繁殖率高、生長發育快、料肉比高、肉質品質好、抗粗飼、采食能力強、適合舍飼圈養等優良特性[5,6]。

()基因最早是由Davi GH等[7]在布魯拉美利奴(Booroola merino)綿羊中發現，是一個具有促進排卵、提高繁殖力的主效基因。在2001年，Mulsant P[8]、Souza CJ[9]和Wilson T[10]等相關研究報道，綿羊6號常染色體上的骨形態發生蛋白受體IB(Bone morphoge netic protein receptor IB，)基因的第746位置處堿基發生了A→G的突變，即基因的突變，導致了編碼區的第249位氨基酸由谷氨酰胺(Q)變為精氨酸(R)，進而促進綿羊排卵數的增加。基因通過促進排卵數的加性效應來發揮分子生物學作用，一個拷貝增加排卵數1.3～1.6個，兩個拷貝增加2.7～3.0個，相對應的產仔數則是，一個拷貝基因控制0.9～1.2，兩個拷貝基因控制1.1～1.7，攜帶該突變基因的母羊排卵數增加，具有較高的繁殖力。因此，國內外研究學者開始廣泛關注基因的研究，Davis GH等[11]在世界上13個國家檢測了21個羊種群，在中國2個品種中發現基因突變，其中包括湖羊和小尾寒羊。國內研究者發現湖羊、小尾寒羊、多浪羊和中國美利奴羊也存在基因[12]。近幾年更多研究發現，洼地綿羊[13]、灘羊[14]、杜泊羊[15]等不僅存在基因，還對其產羔數均具有顯著的加性效應。基因突變對羊繁殖性能發揮的作用，吸引了眾多研究學者的探索，基因多態性對不同羊品種生長發育影響的研究國內外也有較多報道。Gootwine E等[16]對攜帶（Booroola）突變羊研究結果表明，含有基因的羔羊出生體重較低，斷奶后生長速度較慢，母羊成熟體重較輕。另有國外研究者表明，攜帶基因母羊的體尺性狀相比不攜帶基因的小[17]。管峰等[18]將基因多態性與我國9種綿羊品種的產仔數和生長發育進行了研究，結果表明，基因對出生后早期的身體生長具有積極影響。另有研究表明，B+基因型的初生羔羊體尺均顯著低于++基因型（<0.05），基因與羊只的生長發育具有負相關性[19]。楊宇澤等[20]研究結果顯示，基因對小尾寒羊羔羊生長發育未發現產生不利影響，也未發現該基因對羔羊出生后的生長發育有明顯的加性效應。所以，關于基因突變對不同品種羊群生長性狀的研究報道存在爭議，并且大量研究報道都是關于基因對初生或是3月齡羔羊生長發育的影響，與其他年齡綿羊生長性狀的關聯分析尚有較少報道。因此，本次試驗通過研究基因突變對6月齡魯中肉羊生長性狀（體高、體長、胸圍、管圍、尻寬、尻長、胸深、胸寬、腰角寬、坐骨端寬、腹圍）11種體尺指標的影響，以期為基因在魯中肉羊的分子標記輔助育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在山東贏泰農牧科技有限公司選取6月齡生長發育正常，健康無病的魯中肉羊母羊共240只，所有羊只均在半封閉式羊舍內飼養，飼喂日糧是全價混合日糧，定時、定量飼喂，2次/d。溫度、濕度、通風按照日常魯中肉羊養殖場管理規定進行，免疫程序按照肉羊常規程序進行。頸靜脈采集血樣樣品（5 mL/只），使用EDTA抗凝，放置在-20 °C保存備用。

按照規定要求采用直尺，測杖，圓形測定尺，測量6月齡魯中肉羊的表型性狀，包括：體高，體長，胸圍，管圍，尻寬，尻長，胸深，胸寬，腰角寬，坐骨端寬，腹圍。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 實驗儀器PCR儀（美國ABI），凝膠成像儀（上海復日科技有限公司），測序儀（美國ABI），UV-Vis Spectrophotometer（Merinton），冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司)，電泳儀（北京六一儀器廠），電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2.2 實驗試劑Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，瓊脂糖凝膠，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。

1.3 基因DNA提取和檢測

使用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒進行DNA提取，使用分光光度計檢測DNA的濃度和純度，使用1%瓊脂糖、1XTAE緩沖溶液電泳（電壓120～180 V）檢測DNA的質量。

1.4 引物設計與合成

根據NCBI數據庫的基因序列（登錄號：ＮＣ＿056059.１）采用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，引物信息由（表1）所示，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表 1 引物序列

1.5 PCR擴增

以上述DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：模板DNA1.0 μL，F（10 μmol/μL)1.0 μL，R(10 μmol/μL)1.0 μL，Dntp (mix)(10 μmol/μL)1.0 μL，Taq Buffer (with MgCl2)(10X)2.5 μL，Tap酶(5 U/μL)0.2 μL，加ddH20到25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變形30 s，63 ℃退火（每個循環降0.5 ℃，每個循環退火30 s），72 ℃延伸30 s，共10個循環，95 ℃變形30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環，最后72 ℃修復延伸10 min，4 ℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR擴增產物檢測，最后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.6 數據統計與分析

利用popGene32軟件計算基因多態位點在試驗群體中的基因型頻率、基因頻率、純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）和多態信息含量（PIC）等遺傳學參數，并進行2檢驗，判斷其在魯中肉羊群體中是否達到哈代－溫伯格平衡狀態。利用一般線性模型分析不同參數對性狀的影響：模型：＝＋+。式中，：性狀的表型值；：群體的平均值；：基因型效應；：隨機殘差。

使用SPSS26.0軟件的單因素方差分析對突變位點的不同基因型與魯中肉羊生長性狀進行關聯分析，試驗數據使用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 FecB基因測序分型

通過對PCR產物進行測序，發現在g.746A>G位點存在3種基因型（圖1），分別是BB基因型、B+基因型和++基因型。

圖 1 g.746A>G位點BB、B+和++基因型測序分型結果

2.2 魯中肉羊FecB基因突變位點的基因型頻率和基因頻率

根據對基因g.746A>G位點的基因型頻率和基因頻率計算、分析，統計結果如表2所示，BB（49個體）基因型頻率是0.204，B+（157個體）基因型頻率是0.654，++（34個體）基因型頻率是0.142，并且B等位基因頻率是0.531，+等位基因頻率是0.469，即B等位基因頻率高于+等位基因頻率，為優勢等位基因。依據Hardy-Weinberg平衡檢驗可知，該位點在魯中肉羊群體中處于平衡狀態（>0.05）。

表 2 FecB基因g.746A>G位點的基因型頻率、基因頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗

注：括號內的數字表示基因型的個體數。

Note: The numbers in brackets indicate the number of individuals with genotypes.

2.3 魯中肉羊FecB基因突變位點的遺傳參數

魯中肉羊基因g.746A>G位點遺傳參數進行分析結果如表3顯示，該位點的雜合度是0.498，純和度是0.502，有效等位基因數是1.992，多態信息含量是0.374，表現為中度多態(0.25

表 3 FecB基因的遺傳參數

2.4 FecB基因g.746A>G位點與魯中肉羊生長性狀的關聯分析

表 4 FecB基因g.746A>G位點與魯中肉羊生長性狀的關聯分析

注：同行數據肩標相同字母或無字母表示差異不顯著（>0.05)，肩標不同小寫字母表示差異顯著（<0.05），肩標不同大寫字母表示差異極顯著（<0.01）。

Note: In peer data, the same or no letters of shoulder labels indicate no significant difference (>0.05), different lowercase letters of shoulder labels indicate significant difference (<0.05), and different capital letters of shoulder labels indicate extremely significant difference (<0.01).

根據魯中肉羊基因不同基因型與其生長性狀進行關聯分析，結果由表4可知，g.746A>G位點BB基因型的體高顯著低于B+和++基因型（<0.05）；BB基因型的胸圍和腹圍顯著低于++基因型（<0.05），極顯著低于B+基因型（<0.01）；該位點三種基因型的體長、管圍、尻寬、尻長、胸深、胸寬、腰角寬、坐骨端寬均無顯著差異（>0.05)。

3 討 論

魯中肉羊是適合我國北方地區舍飼圈養的專門肉用綿羊新品種[21]，其生長性狀尤其重要。我國展開了關于影響綿羊生長發育的大量研究，關于基因對綿羊生長發育影響的說法大相徑庭。潘洋等[2]通過研究基因對湖羊生長發育的影響，發現基因對產后羊只生長發育具有促進作用，與管峰[18]等研究結果相似。崔緒奎等[22]將基因對杜泊羊與小尾寒羊雜交的3月齡肉羊群體生長性能的聯系進行研究表明，B+基因型母羔羊初生及3月齡斷奶體高、體長、胸圍等體尺指標均顯著小于++基因型；B+基因型的公羔羊各體尺指標也均小于++基因型，但是差異不顯著。近期，Visscher AH等[23]研究表明，攜帶基因的母羊后代羔羊生長速度比不攜帶基因母羊后代慢。陶林等[24]對魯中肉羊育種突變應用效果進行分析，結果顯示，BB基因型初生公羔的體高、胸圍、胸寬、胸深和初生及3月齡母羔的胸深顯著低于++基因型；BB基因型初生公羔體長極顯著低于++基因型；BB基因型初生及3月齡母羔管圍顯著低于++基因型。

本次試驗采用一代測序技術對基因g.746A>G位點進行多態性檢測，隨后使用SPSS軟件分析6月齡魯中肉羊各體尺指標數據與不同基因型的關聯性，結果表明，基因g.746A>G位點BB基因型的體高顯著低于B+和++基因型（<0.05）；BB基因型的胸圍和腹圍顯著低于++基因型（<0.05），極顯著低于B+基因型（<0.01）；該位點三種基因型的體長、管圍、尻寬、尻長、胸深、胸寬、腰角寬、坐骨端寬均無顯著差異（>0.05)。本次試驗與先前基因位點不同基因型與各體尺指標的相關性研究存在一定異同，可能是因為：一方面，年齡、品種等因素的不同，導致基因對生長發育的作用逐漸降低[24]。另一方面，本次試驗樣品只有6月齡，樣本數量少且沒有其他月齡樣品的對照，造成試驗結果具有局限性，因此需要進一步擴大試驗樣本數量來研究其機理作用。但是研究發現基因突變對某些生長性狀的發育具有一定影響，與大多數的研究結果一致。

4 結 論

本次研究結果表明，在魯中肉羊基因g.746A>G位點中存在3種基因型（BB、B+和++），B+為優勢等位基因型，B為優勢等位基因。BB基因型的體高顯著低于B+和++基因型（<0.05）；BB基因型的胸圍和腹圍顯著低于++基因型（<0.05），極顯著低于B+基因型（<0.01）。基因對魯中肉羊的生長性狀存在一定程度的影響。

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The Association ofGene Polymorphism and Body Size in Luzhong Mutton Sheep

ZHANG Ya-nan1, WANG Hao-yuan1, WANG Shu-jun1, ZHANG Ming-zhu1,JI Zhi-bin1,5*, LI Qing1, DU Shan-feng1, CHAO Tian-le1, WANG Jian-min1, WANG Yong2,QI Bao-hua2, XUE Hai-peng2, LI Qiang2, ZHANG Min3, PAN Lin-xiang3, TIAN Hong-fu4, HAN He-guo6, MENG Xian-yu6, ZHANG Tong-chen6

1.271018,2.250300,3.250300,4.271100,5.257400,6.257400,

The purpose of this study was to analysis the effect of the polymorphism of g.746a > G locus ingene on the growth traits of Luzhong mutton sheep. A total of 240 6-month-old Luzhong mutton sheep were selected, the polymorphism ofgene was detected using sanger sequencing technology and agarose gel electrophoresis, and the correlation between different genotypes and growth traits was analyzed by one-way ANOVA. The results showed that there were three genotypes at g.746a > G locus ofGene, BB, B+ and ++, the B+ was the dominant genotype, and B was the dominant allele. The results of genetic parameter analysis indicated that the heterozygosity of g.746a > G locus was 0.498, the homozygosity was 0.502, the number of effective alleles was 1.992, and the content of polymorphism information was 0.374, showing a moderate polymorphism (0.25< PIC <0.5). The results of association analysis showed that the body height of BB genotype at g.746a > G locus was significantly lower than that of B+ and ++ (<0.05); The chest circumference and abdominal circumference of BB genotype were significantly lower than those of ++ genotype (<0.05), and very significantly lower than those of B+ genotype (<0.01); There was no significant difference in body length, tube circumference, rump width, rump length, chest depth, chest width, waist angle width and sciatic end width between the three genotypes (>0.05). In conclusion, the mutationofGene have a certain impact on the growth traits of Luzhong mutton sheep, which provides a reference basis for molecular marker assisted breeding ofGene in Luzhong mutton sheep.

Luzhong mutton sheep;; polymorphism; body size; correlation

S826

A

1000-2324(2022)04-0634-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.04.021

2022-03-14

2022-04-08

山東省農業良種工程項目(2019LZGC012);黃河三角洲學者項目(DYRC20200102)

張亞男(1996-),女,在讀碩士,主要研究方向羊遺傳種與繁殖. E-mail:3014519635@qq.com

Author for correspondence. E-mail:zbji916@sdau.edu.cn