miR-22 調控PI3K/AKT 信號通路對肝癌大鼠的影響

金 丹 金劍英 郭群依 高婭芬 林 紅 杜學峰 謝靜靜

1.浙江省臺州醫院血液腫瘤內科，浙江臺州 317000；2.浙江省臺州醫院肝膽外科，浙江臺州 317000

肝癌患者每年的病死率較高，其主要原因為肝癌起病隱匿，確診時就已喪失最佳外科手術切除的機會，因此手術治療效果不佳，發展分子靶向治療是目前的治療目標。近年來，miRNA 已被證實是多種疾病的有效生物標志物，其在肝癌中的潛在價值也一直被挖掘。研究認為，miRNA 參與癌細胞的發育與分化，轉錄后能夠水平上調靶基因的表達。研究表明，miR–22 在肝癌細胞及組織中高表達，說明miR–22 參與肝癌的發生、發展，且miR–22 的異常表達對肝癌的診斷也存在一定的意義。磷脂酰肌醇–3 激酶（phosphatidylinositol 3–kinase，PI3K）參與增殖、分化、凋亡等多種細胞功能的調節。研究表明，P13K 和其下游A 蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）所組成的信號通路參與腫瘤的發生與發展，并對該通路進行調節，進而對細胞的存活及增殖造成影響。因此，本研究旨在通過下調miR–22 以調控PI3K/AKT 信號通路，觀察其對肝癌大鼠的干預效果。

1 材料與方法

1.1 研究動物

43 只SPF 級健康雄性SD 大鼠，體重100～120g，平均（110.23±8.42）g；鼠齡6～8 周，平均（7.25±1.25）周，購自西安交通大學醫學部實驗動物中心[許可證號：SCXK（陜）2012–003]。所有大鼠均于陜西中醫藥大學實驗中心分籠飼養，喂食標準大鼠飼料，自由攝入食水，室溫（23±2）℃，相對濕度（50±5）%，12h 明暗交替。適應性飼養1周后進入實驗。本研究經浙江省臺州醫院倫理委員會審批通過（倫理審批號：tzy–2020166）。

1.2 方法

1.2.1 儀器準備 離心機（KH20R–Ⅱ，張家港市駿宇離心機制造有限公司）；全自動生化檢測儀（BK–400，山東博科生物產業有限公司）；miRNA提取分離試劑盒（武漢時勝生物科技有限公司）；蛋白印跡試劑盒（上海羽哚生物科技有限公司）。

1.2.2 肝癌大鼠建模按照完全隨機分組法選取10 只大鼠作為空白組，余33 只進行建模。從傳代Wistar 大鼠腹腔抽取癌性腹水5ml，離心半徑10cm，2000 轉/min 離心2min，制成半液態癌性腹水，放入1ml 注射器內備用。于大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300mg/kg）進行麻醉后切開腹部，暴露腹腔，取離體表最近的肝葉進行腫瘤種植。用手指按壓肝葉減少呼吸，注射提前配置好的半液態癌性腹水，注射量0.05ml。注射完畢后，用棉簽在穿刺點位置按壓3min，觀察有無活動性出血，輕輕將肝臟還納腹腔，逐層關腹。

1.2.3 分組及干預 最終成功建模30 只，按照完全隨機分組法將其分為模型組、上調miR–22 組、下調miR–22 組，每組各10 只。通過Lipofectamine 2000將400nm miR–22 inhibitor 轉染到上調miR–22 組、200nm miR–22 inhibitor 轉染到下調miR–22 組，6h 后將其放入10% Dulbecco 的改良Eagle 培養基（Dulbecco's modified of Eagle medium，DMEM），置于37℃的CO培養箱中孵育48h，最后使用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real–time polymerase chain reaction，qRT–PCR）法對miR–22 inhibitor 轉染效果進行檢測。模型組、空白組大鼠均給予等體積的0.9%氯化鈉溶液干預。各組均連續干預2 周。

1.3 觀察指標

1.3.1 qRT–PCR 法檢測miR–22 相對表達量 取出各組大鼠肝組織，經12000 轉/min 離心15min，得到標本提取液，其余步驟嚴格按miRNA 提取分離試劑盒說明書進行。提取細胞總RNA 后，經逆轉錄獲取cDNA，使用Primer5.0 軟件設計引物，以U6 作為內參基因。引物序列如下：miR–22 上游引物：5′–GCACATGCGAATAAGCTGCCAGTTGAAGAA–3′，下游引物：5′–GACGACCCAGTTATCAGTCCGTTT GGAA–3′；U6 上游引物：5′–GGCCTCTCGAACTTG CGTGTC–3′，下游引物：5′–CCATCGGAAGCTCGTA TACGA–3′。采用2方法計算miR–22 相對表達量。檢測3 次，取平均值。

1.3.2 檢測指標 采集大鼠腹主動脈血3ml，2000 轉/min 離心5min（離心半徑5cm），采用BK–400 全自動生化檢測儀檢測谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）。

1.3.3 病理組織觀察 用安樂法處死兩組大鼠后取大鼠的肝組織，并對其進行肉眼觀察，對肝臟病變較為明顯（結節大的）的部位進行切取，然后平均分為2 份，將其中一份置于10%的福爾馬林溶液中，然后對其進行蘇木精–伊紅染色，使用顯微鏡對肝組織的形態進一步觀察分析；其中10%～20%為少量，30%～60%為部分，70%～80%為多數；另一份置于–80℃的冰箱中保存備用。

1.3.4 采用蛋白質印跡（Western blotting）法檢測PI3K、AKT、p–AKT 含量 對標本提取液進行1000轉/min 離心處理，離心半徑5cm，離心5min 后對沉淀物進行提取，并將放射免疫沉淀試驗（radio immunoprecipitation test，RIPA）裂解緩沖液添加到沉淀物中，對其在–80℃與40℃的環境中進行反復凍融后，離心半徑5cm，1000 轉/min 離心5min，提取上清液，其余步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，結果采用LabWorks3.0 軟件以目的條帶β–actin 的灰度值進行分析，重復實驗5 次，取平均值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組miR–22 相對表達量比較

與上調miR–22 組比較，模型組、下調miR–22組大鼠的miR–22 相對表達量較低，且下調miR–22組幅度變化最大，差異均具有統計學意義（＜0.05），見表1。

表1 各組miR–22 相對表達量比較（）

2.2 各組肝功能指標比較

與上調miR–22 組比較，模型組、下調miR–22組大鼠的TBIL、ALT、ALB 水平表達較低，且下調miR–22 組幅度變化最大，差異均具有統計學意義（＜0.05），見表2。

表2 各組肝功能指標比較（）

2.3 各組病理組織觀察

空白組大鼠肝組織正常，肝組織結構清楚，無異樣血管出現；下調miR–22 組大鼠肝組織異常，肝組織結構稍微模糊，少量異樣血管出現；模型組大鼠肝組織異常，肝組織結構模糊，部分異樣血管出現；上調miR–22 組大鼠肝組織異常，肝組織結構模糊，多數異樣血管出現，見圖1。

圖1 各組大鼠病理組織觀察（蘇木精–伊紅染色×200）

2.4 各組大鼠的PI3K、AKT、p–AKT 相對表達量比較

與上調miR–22 組比較，模型組、下調miR–22組大鼠的PI3K、AKT 水平較低，p–AKT 水平較高，且下調miR–22 組幅度變化最大，差異均具有統計學意義（＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠的PI3K、AKT、p–AKT 相對表達量比較（）

圖2 各組大鼠的p–AKT、PI3K、AKT 表達水平比較（Western blotting 條帶圖）

3 討論

肝癌會出現肝內散播現象，目前針對肝癌患者需要一個有效、安全且方便的治療方法。隨著對腫瘤的研究，逐漸開辟一種新型的通過調控信號通路及重要的靶分子治療肝癌的途徑，其主要機制為通過對肝癌分子的改變，從而達到良好的治療效果。

microRNA（miRNA）是一類具有調控功能的非編碼內源性小分子RNA。研究證實，miRNA 在肝癌中具有重要作用，并參與肝癌的發生、發展。隨著對miRNA 的深入研究，發現它可調節多個原癌基因和抑癌基因的表達，還可影響腫瘤的發生、發展及其預后。本研究結果顯示，在肝癌組織中，下調miR–22 可降低TBIL、ALT、ALB 水平，從而對肝癌的發生、發展產生一定的影響作用。分析原因：miR–22 可通過調控靶向基因從而實現激活肝癌細胞的效果，同時該因子作為肝癌上皮–間質轉化過程的啟動子，可以靶向植入同結構域蛋白來轉移肝癌細胞，加重肝癌患者的病情。

抑制AKT 活化，促進p–AKT 表達，可抑制腫瘤細胞的增殖，促進凋亡，抑制腫瘤的進程，表明AKT 活化與細胞的增殖、遷移、侵襲均有關。研究證實PI3K/AKT 是調節細胞分化、增殖、凋亡和衰老的關鍵信號通路。本研究結果顯示，下調miR–22 的表達可使PI3K、AKT 水平降低，p–AKT水平升高。分析原因：p–AKT 參與多種腫瘤的發生、發展，可抑制細胞周期進程，是PI3K/AKT 信號通路的主要細胞周期調控因子，能夠促進細胞凋亡。下調miR–22 可有效抑制AKT 的活性，通過去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇，從而激活PI3K/AKT 信號通路，引起一系列反應促進細胞凋亡。本研究顯示下調miR–22 可減少PI3K、AKT、p–AKT 在癌細胞中的表達水平。

綜上所述，通過下調miR–22 調控PI3K/AKT 信號通路可使大鼠的肝功能得到有效改善，為臨床肝癌靶向治療提供一定的理論依據，但本研究樣本數較少，且未對其關聯性進行深入研究，仍需多中心大樣本研究進行證實。