超高效液質聯用技術分析黃芩-槐花藥對活性成分及其治療慢性腎臟病的網絡藥理學研究

管怡晴，鄭鑫楠，顏夢秋，吳煥賢，張國華*，呂 琳*

超高效液質聯用技術分析黃芩-槐花藥對活性成分及其治療慢性腎臟病的網絡藥理學研究

管怡晴1，鄭鑫楠2，顏夢秋2，吳煥賢2，張國華1*，呂 琳2*

1. 南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510080 2. 南方醫科大學藥學院，廣東 廣州 510080

分析鑒定黃芩-槐花藥對的活性成分，探究活性成分治療慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的潛在作用機制。采用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-ESI-TOF/MS）技術，對黃芩-槐花有效成分進行分析，結合中藥系統藥理學數據庫和分析平臺查找黃芩-槐花中有效成分的作用靶點。分別在比較毒物基因組學數據庫（comparative toxicogenomics database，CTD)、在線人類孟德爾遺傳數據（online mendelian inheritance in man，OMIM）、GeneCards和DrugBank數據庫中以“Chronic kidney disease，CKD”為關鍵詞，查找疾病相關蛋白，用Venny圖取交集篩選出二者共同作用靶點。利用Cytoscape 3.8.2軟件構建“活性成分靶點-疾病”的調控網絡，運用String數據庫獲取蛋白相互作用關系（Protein-protein interation，PPI），將疾病和有效成分的共同核心蛋白進行基因本體論（Gene ontology，GO）以及京都基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并構建“核心靶點-通路”網絡圖。黃芩-槐花藥對共鑒別出29種有效活性成分，其中槲皮素、染料木素、漢黃芩素、山柰酚等17種關鍵活性成分的作用靶點與疾病相關蛋白取交集，共篩選出包括白介素-6（interleukin-6，IL-6）、細胞信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）、趨化因子-8（chemokine factor-8，CXCL-8）等36個核心靶點。對關鍵作用靶點進行通路富集分析，黃芩-槐花藥對中有效成分主要通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 B（protein kinase，PKB，AKT）、Janus激酶（janus kinase，JAK）-信號傳導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）、白介素-17（interleukin-17，IL-17）、晚期糖基化終末化產物（advanced glycation end products，AGE）及晚期糖基化終末產物受體（receptor for dvanced glycation end products，RAGE）等信號通路對慢性腎臟病發揮治療作用。確定了黃芩-槐花藥對中含有的29種有效成分，分析出黃酮類、類黃酮類、黃酮醇類以及皂苷類4類化合物中主要成分漢黃芩苷、槲皮素、山柰酚和槐花皂苷III的質譜裂解規律；探究黃芩-槐花藥對在治療CKD中的潛在機制，為后續臨床應用提供科學的理論基礎。

黃芩；槐花；藥對；UPLC-ESI-TOF/MS；慢性腎臟病；網絡藥理學；漢黃芩苷；槲皮素；山柰酚；槐花皂苷III

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是因為腎臟功能或生理結構改變所導致的一種臨床綜合癥，具有不可逆和緩慢進行的特點。根據2021年世界腎臟大會提出的最新報告，全球約有11.7%的人患有慢性腎臟病[1]。我國慢性腎臟病的患病率同樣高達10.8%，且其發病率一直都在不斷上升中。然而，由于CKD患者在早中期并不表現出明顯的癥狀，直到晚期才會出現典型腎功能不全的并發癥，因此慢性腎臟疾病已成為人類健康生活中不可忽視的潛在殺手。

目前，CKD的臨床治療手段分為保守治療與替代治療2種[2]。然而2種治療方法均具有價格昂貴、患者耐受性差、治療時間長的缺點。因此，尋找有效的輔助療法就變得十分重要。中醫藥在CKD的臨床治療中有其獨特的優勢，某些單味中藥及其提取物以及一些中藥復方可以減輕炎癥損傷，延緩CKD進展，且治療具有不良反應較小、價格相對便宜的優勢。

在我國，黃芩至少有兩千年的藥用歷史，據中醫四大經典著作之一的《神農本草經》記載，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的作用，現已正式收錄于《中國藥典》2020年版、《歐洲藥典》（EP 9.0版）和《英國藥典》（BP 2018版）[3]。槐花出自《日華子本草》，具有一千多年的藥用歷史，其可清肝瀉火、涼血止血。大量臨床研究證明，黃芩與槐花中含有許多活性成分，且對慢性腎臟病具有獨特的治療作用。黃芩素、黃芩苷、蘆丁、槲皮素、槐花皂苷等均具有抗炎效果[3-5]。黃芩苷、黃芩素等黃酮類提取物在小鼠體外關節炎中能緩解踝關節腫脹[6-7]。此外，漢黃芩苷可通過減少細胞產生的炎癥介質一氧化氮（nitric oxide，NO）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），抑制促炎細胞因子的釋放[8-10]。同時有臨床實驗證明漢黃芩素通過抑制炎癥因子進而對慢性腎臟病有較好的緩解作用。此外，槲皮素已被證明可用于治療炎性腸病，其抗氧化劑作用與抑制促炎性介質的釋放作用具有廣闊的研究前景[11-13]。南方醫科大學張國華教授首次提出利用黃芩-槐花輔助治療慢性腎臟疾病，且療效較為顯著[14]。但現階段對此藥對的有效成分尚不清楚，且其具體作用機制仍需探究。本研究采用UPLC-ESI-TOF/MS技術對黃芩-槐花中的多種化學成分進行分析鑒定，并通過生物信息學分析手段，構建多成分、多靶點的相互作用網絡圖，探究黃芩-槐花中有效成分可能的調控機制，為此藥對的臨床運用提供充分的科學依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器與設備

島津LC-30A色譜儀，AB Sciex Triple TOF 5600+質譜儀，C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Thermo Scientific，美國），Xcalibur 2.2.0化學工作站Centrifuge5702型離心機（Eppendorf），AL204型電子天平（梅特勒-托利多公司），KQ3200DE型超聲超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），超純水制備儀（Millipore），0.22 μm微孔濾膜（Pall Corporation 6229286）。

1.2 材料

黃芩（批號70704610）、槐花（批號7110901）免煎顆粒均購自南方醫院，為廣東一方制藥有限公司生產。對照品漢黃芩苷（批號P09J8F28374）購自上海源葉生物科技有限公司、槲皮素（批號LP087-201408）、山柰酚（批號LP057-201406）購自沈陽瀧浦科技有限公司，對照品質量分數均≥98%。甲醇（分析純，天津大茂化學試劑廠），甲醇色譜純（OCEANPAK ME-00040203），甲酸色譜純（Aladdin K1414066），乙腈色譜純（OCEANPAK 000406281/03），實驗用水為超純水。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

分別精密稱取黃芩、槐花樣品各0.3 g至10 mL EP管中，加入甲醇-水溶液8 mL，超聲處理30 min，13 000 r/min，離心10 min，取上清，過0.22 μm微孔濾膜，裝入1.5 mL自動進樣瓶內，最終獲得黃芩-槐花藥對的樣品提取液。空白對照樣品也經相同條件與步驟處理。將處理好的提取物置于4 ℃的冷藏環境儲存，在分析前取出，保存時間不能超過24 h。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取漢黃芩苷、槲皮素、山柰酚對照品適量，用70%甲醇水溶液溶解，配制成質量濃度為1 mg/mL的對照品儲備液，?20 ℃保存備用。精密量取1 mg/mL的各儲備液用甲醇稀釋后得到混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

HALO C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），柱溫為40 ℃，體積流量0.3 mL/min，進樣量為5 μL，檢測波長為360 nm。梯度洗脫條件見表1。

2.4 質譜條件

電噴霧離子源（electronic spray ion，ESI）正負離子模式掃描，正離子電壓為5500 V，離子源溫度為 600 ℃，去簇電壓（declustering power，DP）為100 V，碰撞能量（collision energy，CE）為35 V，碰撞能量擴展（collision energy expansion，CES）為15 V。負離子電壓為?4500 V，離子源溫度為500 ℃，DP分別為100 V，CE分別為?35 V，CES為15 V。霧化氣體為氮氣，GS1壓強為413 kPa，GS2壓強為344 kPa，輔助氣為275 kPa。一級質譜母離子掃描范圍為/50～1000，IDA設置響應值超過100 cps的6個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為/50～1000，開啟動態背景扣除（dynamic background subtraction，DBS）。

表1 色譜洗脫梯度條件

Table 1 Gradient conditions of chromatographic elution

tR/minA/%B/% 0.01955 15.007030 30.00995 32.00595 35.000100

2.5 質譜分析

對樣品溶液所得總離子流圖進行分析，推測成分的分子式，并與中藥系統藥理學分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http:// libts.hkbu.edu.hk lLSP/tcmsp.php）數據庫[15]中收錄的中藥成分進行比對，初步確定各化合物類型后，將得到的化合物進行分類，根據各化合物所屬大類的質譜裂解規律，質譜碎裂的分子離子峰與碎片離子峰同時參照相關文獻推測化合物在負離子模式下的裂解路徑，并與所得二級質譜圖進行比對。

2.6 黃芩-槐花藥對活性成分靶點篩選和疾病靶點匯集

借助TCMSP（http://libts.hkbu.edu.hk lLSP/ tcmsp.php）檢索出黃芩槐花所含的29種有效成分，包括蘆丁、漢黃芩苷、槲皮素、黃芩素、山柰酚、漢黃芩素等，同時匯集活性成分對應的有效靶點，將納入的活性化合物和有效靶點進行刪除重復值處理，最后以表格形式闡明化合物基本信息。

CTD數據庫有助于了解影響疾病的分子機制以及基因和蛋白質之間復雜的相互作用網絡。OMIM數據庫側重于呈現疾病表型與其致病基因的關聯。GeneCards數據庫可查詢基因的基本功能，還可查詢疾病相關的基因列表。DrugBank數據庫是臨床導向的藥品百科全書，可提供藥物靶目標、藥物作用機制的詳細信息。分別在CTD（http://lctdbase.org/）、OMIM（https://llomim.org/）、GeneCards（https://l/www.genecards.org/）和DrugBank（https://llgo.drugbank.com/）數據庫中以“chronic kidney disease”為關鍵詞進行查詢，得到與CKD相關的基因，整合各數據庫的結果，刪除重復結果，得到疾病相關蛋白。

2.7 Venny分析共有靶點

為了進一步得到黃芩-槐花中29種有效成分治療CKD的潛在靶點，將篩選得到的269個CKD相關蛋白與黃芩-槐花有效活性成分的246個治療靶點信息分別導入Uniport（https://www.uniprot org/）網站進行Gene Symbol轉換，利用Venny2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）軟件取交集篩選獲得靶基因。

2.8 PPI網絡構建

通過String 10.0軟件（http://string db.org）分析黃芩-槐花治療慢性腎臟病靶基因之間的相互作用，設定置信度閾值＞0.7,得到相互作用關系，將其導入Cytoscape 3.8.2中，利用富集插件cytohubba篩選核心靶點，并構建PPI網絡圖，將結果可視化。

2.9 基因本體論（gene ontology，GO）以及京都基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

通過Cytoscape插件BiNGO3.0.3對目的基因進行GO以及KEGG分析，進一步了解靶基因的功能及在信號通路中的調節作用，設定＜0.01篩選相應的GO條目，繪制功能富集圖。應用Clue GO插件繪制信號通路圖，選擇前10條通路進行分析。

3 結果

3.1 黃芩-槐花藥對的正、負離子流圖

通過采用液質聯用飛行時間質譜儀對黃芩-槐花提取物進行分析，得到該藥對的正、負離子流圖，如圖1所示。

3.2 有效成分鑒定及分類

與TCMSP數據庫中收錄的中藥成分進行比對，共檢測到29種中藥活性成分，根據化合物的母環以及取代基的結構特點，對以上活性成分進行分類以及對應離子碎片結果見表2。

圖1 黃芩-槐花藥對提取物(空白組背景扣除) 正 (A)、負(B) 離子模式下總離子流圖

表2 UPLC-Q-TOF-MS黃芩槐花藥對中含有的化合物

Table 2 Compounds ofSB-SJdrug pairby UPLC-Q-TOF-MSanalysis

序號tR/min分類名稱MS (m/z)加合離子分子式 110.32查耳酮類2,6,2′,4′-四羥基-6′-甲氧基查耳酮301.072 [M＋H]+C16H14O6 28.01類黃酮類蘆丁609.145[M＋H] +C27H30O16 38.90山柰酚-3-O-蕓香糖苷593.151[M＋H] +C27H30O15 48.53槲皮素301.035[M＋H]+C15H10O7 512.73黃酮類漢黃芩苷459.092[M＋H] +C22H20O11 610.73黃芩苷445.077[M＋H]+C21H18O11 718.37黃芩新素II373.093[M＋H]+C19H18O8 815.05黃芩素269.046[M＋H]+C15H10O5 914.60去甲漢黃芩素269.046[M＋H]+C15H10O5 1018.03漢黃芩素283.062[M＋H]+C16H12O5 1111.06粘毛黃芩素III345.061[M＋H]+C17H14O8 1218.23白楊素253.051[M＋H]+C15H10O4 1319.14黃芩黃酮343.082[M＋H]+C18H16O7 1418.62黃芩黃酮I313.072[M＋H]+C17H14O6 1515.29粘毛黃芩素II329.066[M＋H]+C17H14O7

續表2

序號tR/min分類名稱MS (m/z)加合離子分子式 1617.33皂苷類（五環三萜）大豆皂苷Bb941.512[M＋H]+C48H78O18 1717.93槐花皂苷III925.517[M＋H]+C48H78O17 1811.39二氫黃芩素447.093[M＋H]+C21H20O11 199.34二氫黃芩苷447.092[M＋H]+C21H20O11 2011.585,7,2′,6′-四羥基二氫黃酮醇287.050[M＋H]+C15H12O6 2113.41滇黃芩新苷301.720[M＋H]+C16H14O6 2210.737,2′,6′-三羥基-5-甲氧基二氫黃酮297.040[M＋H]+C16H10O6 2318.70二氫木蝴蝶素A285.077[M＋H]+C16H14O5 2411.04二氫黃酮醇類左旋圣草素287.056[M＋H]+C15H12O6 2510.73異黃酮類染料木素269.045[M＋H]+C15H10O5 2610.322,6,2′,4′-四羥基-6′-甲氧基查耳酮301.072[M＋H]+C16H14O6 2712.44黃酮醇類粘毛黃芩素I301.036[M＋H]+C15H10O7 2814.57山柰酚285.041[M＋H]+C15H10O6 2914.90異鼠李素315.051[M＋H]+C16H12O7

3.3 有效成分分析

從29種化合物中，選取漢黃芩苷（黃酮類）、槲皮素（類黃酮類）、山柰酚（黃酮醇類）以及槐花皂苷III（皂苷類）4種代表性化合物進行波譜解析。

3.3.1 漢黃芩苷 負離子模式下，質譜圖顯示化合物相對分子質量為/459.092 9，見圖2。在TCMSP中與黃芩-槐花有關的中藥化合物成分進行比對，發現漢黃芩苷的相對分子質量與其相近，漢黃芩苷為黃酮類取代衍生化合物，其相對分子質量為459.092 9，在高能碰撞的正離子掃描模式下，此化合物往往先丟失1個電子，從而生成質量為459的碎片離子峰。在正離子掃描模式下，由于漢黃芩苷為葡萄糖醛酸取代的黃酮類衍生物，較易先脫去葡萄糖醛酸部分[M－193]，即首先丟失1分子葡萄糖醛酸自由基，得到碎片離子/283。接下來，脫去母環上的甲基自由基，得到碎片離子/268。根據以上規律，將各個標志性碎片離子與得到的二級質譜圖比對，發現主要碎片質量基本一致，結合以往文獻報道[16]進一步可確定此化合物即為漢黃芩苷，漢黃芩苷的二級質譜以及可能的裂解途徑如圖2所示。

圖2 漢黃芩苷的一級(A)、二級(B) 質譜圖和可能的裂解途徑 (C)

3.3.2 槲皮素 在負離子模式下，通過質譜圖獲得的化合物相對分子質量為/301.035 8，見圖3，經比對，發現槲皮素與之相匹配，槲皮素的相對分子質量為302.238 7，其在高能碰撞的負離子的掃描模式下，此類化合物往往發生丟失1個氫離子，從而生成質量為301的碎片離子峰。在負離子掃描模式下它的準分子離子裂解規律為標志性的逆-迪爾斯-阿德裂解，即RDA裂解[17]，從而分離出標志性的碎片離子/283、175、151。由于槲皮素易發生中性碎片丟失，脫去H2O，即脫去C環3位上的羥基與B環6′位氫，脫水后得到碎片離子/283。通過RDA反應，C環裂解，分別得到碎片離子/151和/175。根據以上規律，將各個標志性碎片離子與得到的碎片離子峰圖對比，標志性碎片的相對分子質量相同，結合相關文獻記載的裂分規律可進一步推斷該化合物即為槲皮素，槲皮素可能的分子裂解途徑見圖3。

3.3.3 山柰酚 在負離子模式下，通過MS譜圖獲得的化合物相對分子質量為/285.041 4，見圖4，與黃芩-槐花有關的中藥化合物成分比對后，確定與之相對分子質量最相似的化合物為山柰酚，通過二級質譜，進一步確定山柰酚為黃酮醇類化合物，中間環被羥基取代導致其穩定性較弱，裂解規律為此環失去1個羰基和取代的羥基 [M－28－17]，生成相對分子質量為239的標志性離子峰。然后，脫去母環上的3個小分子羥基[M－52]，生成相對分子質量為187的標志性離子峰。黃酮醇類化合物由于羥基取代，因此較少發生RDA裂解[18]，而是發生上述方式的裂解，見圖4。根據此規律，將各個標志性碎片離子與得到的碎片離子峰圖對比，標志性碎片的相對分子質量相當，確定此化合物為山柰酚。

圖3 槲皮素的一級(A)、二級(B) 質譜圖和可能的裂解途徑(C)

圖4 山柰酚的一級(A)、二級(B) 質譜圖和可能的裂解途徑(C)

3.3.4 槐花皂苷III 如圖5所示，在負離子模式下，通過MS譜圖獲得的化合物分子質量為/925.5174，在TCMSP數據庫中尋找相關成分，發現槐花皂苷III質量與其相近，故初步確定其為槐花皂苷。接下來對其進行二級質譜分析。在其二級質譜圖中可以觀察到2個離子峰之間相差416，根據環三萜類皂苷裂解規律，此類化合物首先斷開末端的鼠李糖[19]，然后脫去小分子基團如羥基，羧基等相連的碎片峰，最后進行RDA裂解。此裂解方式為五環三萜類皂苷天然化合物的標志裂解，將各個標志性碎片離子與得到的碎片離子峰圖對比，標志性碎片的相對分子質量相當，進一步確定此化合物為槐花皂苷III。槐花皂苷的二級質譜以及推測裂解途徑如圖5所示。

3.4 活性成分-靶點網絡的建立和拓撲分析

借助TCMSP搜索質譜分析中檢測出的29種活性成分，包括蘆丁、漢黃芩苷、槲皮素、黃芩素、山奈酚、漢黃芩素等，刪除重復并去除假陽性，整合得到17種有效成分及246個靶點。其中，槲皮素作用靶點最多，為127個，其次是染料木素75個，漢黃芩素72個（表3）。利用Cytoscape 3.8.2構建活性成分-靶點網絡圖（圖6），該網絡涉及266個節點和493條邊，外圍節點代表化合物，中央節點表示藥物靶點，每條邊代表化合物與靶點之間的互作關系。

3.5 潛在靶點預測

分別在CTD、OMIM、GeneCard和DrugBank 數據庫中以“Chronic kidney disease，CKD”為關鍵詞進行查詢，整合各數據庫的結果，去除重復結果，篩選出269個CKD相關靶點，應用Venny2.1.0軟件獲得40個藥物與疾病的共有靶點（圖7）。為了進一步探究黃芩-槐花的有效成分在治療慢性腎臟病中的潛在靶點，運用Cytoscape 3.8.2軟件繪制有效成分靶點與疾病靶點的作用關系（圖8），藍節點代表黃芩-槐花藥對有效成分靶點，綠節點代表CKD疾病相關蛋白，連線表示兩者的相互作用。

3.6 PPI網絡構建與分析

基于String和Cytoscape3.8.2軟件構建有效成分與疾病相關靶點的蛋白互作網絡關系，并利用cytohubba 插件篩選核心靶點（圖9）。該圖由36個蛋白質節點和125條邊組成，邊代表蛋白間相互作用關系，線條越多表示關聯度（degree）越大，節點的大小和顏色均代表degree值的大小。依據網絡拓撲學性質可知，有較多節點的化合物或藥物靶點在整個網絡中可能起到核心作用，由此預測黃芩-槐花藥對中的關鍵蛋白可直接干預CKD的作用機制，靶點及值排名見表4。

3.7 GO與KEGG通路分析

對核心靶點進行GO和KEGG富集分析，以＜0.05為篩選閾值，選取前10的GO分析（圖10），GO分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）；對前20的KEGG代謝通路繪制氣泡圖（圖11），氣泡面積代表通路富集基因數，面積越大，則參與該功能的靶基因越多，氣泡顏色代表值大小，顏色越紅，值越小。黃芩-槐花藥對治療CKD的GO分析中BP與上皮細胞增殖（epithellal cell prollferation）、氧化應激（response to oxidative stress）、活性氧代謝（reactive oxgen spocies metabolic process）、酪氨酸磷酸化（reguation of pepioyr tyrosine poshryatot）、JAK-STAT通路等相關。在CC中作用靶點主要富集在膜筏（membrane raft）、胞質囊腔（cytoplasmicvesicle lumen）、膜微區（membrane microdomain）、胞吞泡（endocytic vesiclet）、RNA聚合酶II轉錄因子調控（RNA polymerase II transcription factor complex）等。而MF方面靶點主要富集在細胞因子受體結合（cyokine receptor binding）、生長因子受體結合（growth factor receptor binding）、蛋白磷酸化（protein phosphatase binding）等。黃芩-槐花藥對治療CKD的KEGG代謝通路與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis，degree 16）、PI3K-Akt（degree 15）、晚期糖基化（AGE-RAGE，degree 15）、JAK-STAT（degree 13）、流體剪切應力（fluid shear stress and atherosclerosis，degree 13）、缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1，degree 11）等密切相關。

表3 黃芩-槐花藥對活性成分靶點預測基本信息預測

Table 3 Prediction potential targets of active ingredients of SB-SJdrug pair

MOL ID活性成分degree值MOL ID活性成分degree值 MOL000098槲皮素127MOL002560白楊素11 MOL000481染料木素75MOL002927黃芩新素II11 MOL000173漢黃芩素72MOL002932黃芩黃酮Ⅰ9 MOL000422山柰酚50MOL002919粘毛黃芩素III7 MOL002714黃芩素28MOL000525去甲漢黃芩素6 MOL012266黃芩黃酮22MOL005190左旋圣草素5 MOL003653槐花皂苷III19MOL002916粘毛黃芩素II4 MOL000415蘆丁17MOL0029255,7,2′,6′-四羥基二氫黃酮醇3 MOL002917粘毛黃芩素II17

圖6 黃芩-槐花藥對活性成分-靶點網絡圖

圖7 黃芩-槐花藥對活性成分-慢性腎臟病靶基因韋恩圖

圖8 藥物活性成分-靶點-疾病網絡圖

圖9 活性成分-疾病靶點互作網絡圖

表4 黃芩-槐花藥對中的關鍵靶點預測及P值排序

Table 4 Prediction of key targets and ordering of P values of SB-SJdrug pair

核心靶點P值核心靶點P值核心靶點P值 IL-621CCL-210CCND15 STAT317MAPK110APOA14 TNF17TP5310CRP3 VEGFA13FN-19NOS33 CXCL-812INS9PPARG3 IL-1312STAT19SPP13 IL-1β12EGF8CFTR2 IL-412ICAM17HMOX12 AKT111IFNG7ATM1 EGFR11MMP67MPO1 IL-1011MYC6PON11 IL-211

3.8 有效成分-核心靶點-通路網絡圖的構建

根據蛋白靶點與信號通路之間的相互作用關系，選取關鍵的前20條可能與CKD相關的通路，同時與黃芩-槐花活性成分的作用靶點一一對應，構建活性成分-CKD核心靶點-通路多維網絡圖（圖12）。節點的degree值代表網絡中與該節點相連的邊的數量。黃芩-槐花藥對有效成分-靶點-通路網絡圖含有53個節點、32條通路、21個個靶點、以及446條邊；最大degree值為16，最小為1，平均degree值8.4，其中13個靶點，18條通路在平均值以上。

4 討論

現代研究表明，CKD的發生發展過程與氧化應激、炎癥反應、血管硬化以及自身免疫等病理生理機制密切相關[20]。黃芩作為一種傳統植物，在中國已有數千年的藥用歷史，多項研究表明黃芩通過抑制促炎因子IL-1β、IL-18、TNF-α的產生，發揮顯著的免疫抑制作用，廣泛應用于肝炎、肺炎、腸炎、過敏反應、痢疾、呼吸道感染等疾病的治療[21]。同時課題組前期研究證明漢黃芩素可治療慢性腎臟疾病，其通過抑制炎癥因子的產生以及抑制氧化應激通路來達到調節腸道菌群，進而減輕腎臟損傷[14]。

本研究定性鑒別了黃芩-槐花藥對中29種活性成分，如黃芩素、黃芩苷以及槐花中含有的蘆丁、槲皮素、槐花皂苷等，這些活性成分都已證明具有抗炎效果。如黃芩苷可通過上調腸內NF-κB和p65蛋白水平，激活NF-κB信號通路，以提高下游抗炎細胞因子和IL-8、IL-6、IL-10、IFN-γ的蛋白表達水平，降低腸道炎癥和氧化作用，從而治療潰瘍性腸道炎癥[22-23]。此外，漢黃芩苷已被證明可通過減少巨噬細胞和中性粒細胞的肺浸潤來改善脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷[24]。姜紅寶等[25]研究者證明蘆丁可改善四氧嘧啶誘導的糖尿病腎病大鼠，其機制可能與抑制醛糖還原酶活性和消除氧自由基有關，阻止葡萄糖轉變為山梨醇，減弱山梨醇通路對大鼠造成的損害。另外，蘆丁可降低腎組織脂質過氧化物酶（lipid peroxidase，LPO）活性，延緩氧自由基對機體的進一步損傷。蘆丁還可通過NO-鳥苷酸環化酶途徑產生內皮依賴性的血管舒張作用[26]。有研究表明槲皮素與蘆丁有相似的抗氧化以及血管舒張作用[27]，同時，槲皮素還被證明對口腔癌、多發性骨髓癌、白血病等多種癌癥具有化學治療作用[28-30]。另外，槲皮素能夠顯著抑制急性痛風性關節炎模型大鼠的腫脹程度，降低炎癥反應，減少炎癥因子IL-1β、COX-2及NO水平，從而證實槲皮素有較強的抗炎作用[31-32]。本研究利用TCMSP數據庫預測到黃芩-槐花中17種活性成分在治療CKD過程中發揮作用的潛在靶標共36個，關鍵潛在靶點包括IL-6、MAPK1、AKT1、TNF、STAT3、IL-1β等，各靶點之間相互關聯，具有協同治療作用。活性成分-CKD靶標-KEGG通路網絡結果顯示，黃芩-槐花藥對治療CKD涉及多個信號通路。有研究表明黃芩苷能減輕HT-29細胞炎癥反應，抑制P13K磷酸化，下調AKT的活化，抑制NF-κB的活化入核，從而抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌，發揮其抗炎效應[33]。黃芩苷還可通過抑制NLRP3炎性小體和TLR4/NF-κB信號通路，減輕認知障礙，保護神經元免受小膠質細胞介導的神經炎癥[34]。黃芩苷還通過上調腺苷A2a受體、下調轉化生長因子TGF-β1和磷酸化ERK1/2，抑制博來霉素誘導的肺纖維化[35-36]。

圖10 GO-BP、GO-CC、GO-MF富集分析

圖11 KEGG富集分析

圖12 黃芩-槐花藥對有效成分-靶點-通路網絡

中藥在治療慢性腎臟病方面具有顯著療效，可通過調節一系列信號通路減輕腎組織的炎性損傷，延緩CKD進展[37]，但是仍面臨藥物成分多，靶點不明確，作用機制復雜的困難。本研究通過高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術分析有效成分，再結合網絡藥理學初步探究并推測黃芩-槐花藥對主要通過影響HIF-1、TNF、NF-κB、MAPK、P13K-AKT等信號通路共同參與機體細胞凋亡調控、炎癥反應、缺氧反應、血管生成、老化、血管內皮調控等生物過程以達到治療CKD的目的，以期為后續研究提供思路與依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of effective components of-drug pair by UPLC-ESI-TOF/MS and network pharmacology analysis of its effect on chronic kidney disease

GUAN Yi-qing1, ZHENG Xin-nan2, YAN Meng-qiu2, WU Huan-xian2, ZHANG Guo-hua1, LYU Lin2

1. School of Traditiongal Chinese Medicine, Southern Medicial University, Guangzhou 510080, China 2. School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medicial University, Guangzhou 510080, China

To establish the identification and analysis method of effective ingredients of(SB-SJ) drug pair, and explore the potential mechanism in the treatment of chronic kidney disease (CKD) by network pharmacology analysis.Ultra Performance Liquid Chromatography Electrospray Ionization-ion Trap-time Of Flight mass spectrometry (UPLC-ESI-TOF/MS) was used to analyze the active components ofSB-SJ drug pair. Seeking the action targets of SB-SJ drug pair via the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platfom (TCMSP), and the disease-related proteins were found by using the key words "Chronic kidney disease" in Comparative Toxicogenomics Database (CTD), Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards and DrugBank databases, respectively. In addition, the interaction between the targets of active components and disease was analyzed on Venny platform, and the same targets of two were then screened. The regulatory network of "active component-disease targets" was constructed by Cytoscape 3.8.2 software. Moreover, the PPI was obtained by String software. The function and pathway enrichment analysis of core proteins were used GO and KEGG, and the "core target-pathway" network was further constructed.A total of 29 kinds of effect components were identified, including one chalcone, three flavonoids, eleven flavonoids, two saporins (pentacyclic titerpenes), seven dihydrofavonoids, one dihy doflavonol, one isoflavone and three flavonols. Among them, there were 17 active ingredients related to CKD, such as quercetin, genistein, wogonin and kaempferol, which were intersected with disease targets, and 36 core targets containing IL-6, STAT3, TNF, VEGFA and CXCL-8 were screened. According to the pathway enrichment analysis of the key targets, the active components of SB-SJ drug pairhave the therapeutic effect on CKD mainly through PI3K-AKT, JAK-STAI, IL-17, AGE-RAGE and other signal pathways.In this study, 29 active components in SB-SJ drug pairwere determined, and the mass spectrometric cleavage rules of wogonoside, quercetin, kaempferol and kaikasaponin III were analyzed. Based on network pharmacology, the mechanism of SB-SJ drug pair in the treatment of CKD was explored, which provides a scientific basis for future clinical application.

Georgi;L.; drug pair; UPLC-ESI-TOF/MS; chronic kidney disease; network pharmacology; wogonoside; quercetin; kaempferol; kaikasaponin III

R284.1

A

0253 - 2670(2022)20 - 6388 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.011

2022-03-14

廣東省自然科學基金項目(2019A1515011124）；廣東省自然科學基金項目(2021A1515011674）

管怡晴（1993—），女，碩士研究生，專業方向為中西醫結合治療心血管疾病。Tel: 13411214868 E-mail: 1040052@qq.com

張國華，男，教授，主任醫師，博士，研究方向為中西醫結合治療心血管疾病。Tel: 13189098311 E-mail: zghgz@163.com

呂 琳，女，副教授，博士，研究方向為抗乳腺癌藥物的藥理學研究。Tel: 13560490259 E-mail: lynnlv@smu.edu.cn

[責任編輯 王文倩]