活血榮絡方調控生物鐘蛋白Bmal1改善bEnd.3細胞糖氧剝奪/復氧損傷后血管新生的機制研究

張宇星，張 瑛，曾富康，郭 純，高曉峰，李 中，陳 瑤，周德生*，劉利娟*

活血榮絡方調控生物鐘蛋白Bmal1改善bEnd.3細胞糖氧剝奪/復氧損傷后血管新生的機制研究

張宇星1，張 瑛1，曾富康1，郭 純2，高曉峰2，李 中2，陳 瑤2，周德生2*，劉利娟2*

1. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410000 2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410000

基于陰陽理論及活血榮絡方（Huoxue Rongluo Recipe，HXRL）對腦梗死后血管新生的影響，探討HXRL調控生物鐘蛋白腦和肌肉芳烴受體核轉位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，Bmal1）促內皮細胞血管新生的作用機制。采用Western blotting檢測小鼠腦微血管內皮細胞株（bEnd.3）受到糖氧剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷后各時間點生物鐘蛋白Bmal1和Clock的表達；利用染色質免疫共沉淀-測序分析（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）明確Bmal1在全基因組中發揮的作用，以及對bEnd.3細胞生物進程、細胞組成及分子功能的影響。采用CCK-8法檢測HXRL含藥血清最佳干預濃度，敲降bEnd.3細胞基因，設置對照組、模型組、HXRL含藥血清組、si-Bmal1組和si-Bmal1＋HXRL含藥血清組，通過劃痕、遷移、成管等實驗檢測細胞遷移及血管形成能力；采用免疫熒光檢測各組血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和神經源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）表達；采用Western blotting檢測VEGF、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP2）、Notch1蛋白胞內結構域（notch1 intracellular domain，NICD）和δ樣蛋白4（delta-like protein 4，DLL4）蛋白表達。bEnd.3細胞受到OGD/R損傷后，Bmal1及Clock蛋白表達逐漸升高，造模8、12、16、20 h后具有顯著差異（＜0.05、0.001）。ChIP-seq提示Bmal1在內皮細胞中參與細胞發育、分化、增殖等進程，靶向調節VEGF、Notch1啟動子區域。CCK-8實驗結果顯示，bEnd.3細胞受到OGD/R損傷后，10%的HXRL含藥血清可有效改善細胞活力（＜0.001）。劃痕、遷移及成管實驗證實HXRL含藥血清可有效改善bEnd.3細胞OGD/R損傷后的遷移能力及血管生成能力（＜0.05、0.01、0.001），但在敲降株中，該促進作用被抑制（＜0.05、0.01、0.001）。免疫熒光及Western blotting結果顯示，HXRL含藥血清可進一步升高OGD/R損傷的bEnd.3細胞中VEGF、MMP2、NICD、DLL4、Bmal1及Clock蛋白表達（＜0.05、0.01、0.001），在敲降株中，HXRL含藥血清對VEGF、MMP2、NICD及DLL4的促表達作用被抑制（＜0.05、0.01、0.001）。HXRL可有效促進內皮細胞經OGD/R損傷后的血管生成能力，其作用機制與調控生物鐘Bmal1蛋白密切相關。

活血榮絡方；腦梗死；生物鐘蛋白Bmal1；氧糖剝奪；Bmal1敲降株；血管新生

缺血性腦卒中（ischemic cerebral stroke，ICS）是嚴重危害我國國民健康的重大慢性非傳染性疾病，具有高發病率、高致殘率、高死亡率、高復發率、高經濟負擔5大特點[1-2]。研究表明，腦梗死周圍區域的缺血區微血管密度（microvessel density，MVD）增加可提高ICS患者的生存時間[3]。盡快建立三級側支循環——新生血管可恢復局部血流供應，挽救缺血半暗帶內瀕臨死亡的神經細胞，為神經-血管結構的可塑性創造良好的微環境，恢復缺損的神經功能，改善患者預后，是當前治療的有效策略之一[4-6]。生物節律是生物體在進化過程中，為適應光照、溫度等自然節律變化而形成的以24 h為周期的節律活動[7]。眾多生物鐘基因[、腦和肌肉芳烴受體核轉位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，）、、]的轉錄/翻譯反饋回路（transcriptional/translational feedback loops，TTFLs）產生細胞自主節律，影響著機體的炎癥免疫、代謝等生理病理過程[8-9]。生物節律顯著影響腦卒中的易感性、損傷、恢復和對治療的反應機制[10]，生物節律紊亂可加重腦梗死后神經功能缺損癥狀，增加腦梗死面積[11]。過表達生物鐘基因可促進腦梗死后血管新生，研究表明，機體受到缺血缺氧損傷后，可通過上調內皮細胞（endothelial cells，ECs）的血管內皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素（angiopoietin，ANG）的表達，促進血管新生[12-13]。

活血榮絡方是本課題組根據治療腦梗死多年的臨床經驗，在“榮氣虛滯理論”的指導下，依據陰虛血瘀病機，制定的具有調和陰陽、養陰生津、活血養血、舒筋活絡通脈功效的科室協議方，其組成以雞血藤、石楠藤為君，生地黃、玄參、黃精為臣，乳香、沒藥為佐、川芎為使[14]。本課題組前期研究發現，活血榮絡方可明顯增加腦梗死大鼠海馬區CD34陽性細胞及皮質區VEGF表達，增加缺血區MVD，促血管新生[15]。本研究旨在探討生物鐘蛋白Baml1對內皮細胞血管新生的影響以及活血榮絡方的干預機制。

1 材料

1.1 動物與細胞株

SPF級SD雄性大鼠20只，12～15周齡，體質量250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002，于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心飼養，實驗許可證號SYXK（湘）2015-0003，依照實驗動物中心管理辦法，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%，通風良好，晝夜交替，分籠標準飼料、自由飲水，適應性飼養7 d后用于實驗。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（倫理批準號ZYFY20211016）。

1.2 細胞株

小鼠腦微血管內皮細胞株（bEnd.3，批號CL-0598）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 藥材

雞血藤、石楠藤、生地黃、玄參、黃精、乳香、沒藥、川芎均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院張裕民主任藥師鑒定分別為豆科植物密花豆Dunn的干燥藤莖、胡椒科植物石楠藤(Miq.) Hand.-Mazz.的干燥帶葉莖枝、玄參科植物地黃Libosch.的干燥塊根、玄參科植物玄參Hemsl.的干燥根、百合科植物黃精Red.的干燥根莖、橄欖科乳香樹屬植物乳香樹Birdw.樹皮滲出的樹脂、橄欖科植物地丁樹Engl.的干燥樹脂、傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖，均符合《中國藥典》2020年版規定。

1.4 藥品與試劑

嘌呤霉素（批號P8230）購自北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（批號164210-50）、青霉素-鏈霉素混合液（批號PB180120）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（批號PB180229）、DMEM高糖培養基（批號PM150210）、DMEM無糖培養基（批號PM150270）、PBS緩沖液（批號PB180327）、無血清非程序凍存液（批號PB180438）均購自武漢Procell公司；CCK-8試劑盒（批號CK04）購自日本同仁公司；Matrigel基質膠（批號356234）購自美國BD公司；Transwell 24孔板（批號3422）購自美國Corning公司；β-actin抗體（批號20536-1-AP）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體（批號10373-2-AP）、神經源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）抗體（批號10062-2-AP）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號SA00001-2）購自武漢Proteintech公司；VEGF抗體（批號ab52917）、Bmal1抗體（批號ab3350）、驢抗兔IgG H&L抗體（批號ab150075）購自英國Abcam公司；Clock抗體（批號sc-271603）購自美國Santa公司；δ樣蛋白4（delta-like protein 4，DLL4）抗體（批號A12943）購自武漢Abclonal公司；Dylight 549標記的山羊抗兔IgG抗體（批號A23320）購自美國Abbkine公司；siRNA慢病毒載體由上海漢恒基因科技有限公司提供。

1.5 儀器

3427型普通培養箱、3131型三氣培養箱、900Series型超低溫冰箱、Fresco17型低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；TD5A型低速離心機（長沙英泰儀器有限公司）；SYG-1210型恒溫水浴鍋（美國Crystal儀器公司）；Axio Vert.A1型倒置顯微鏡（德國ZEISS公司）；Cytation3型多功能酶標儀（美國BioTek公司）；SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）。

2 方法

2.1 活血榮絡方的制備

取雞血藤30 g、石楠藤30 g、生地黃15 g、玄參10 g、黃精15 g、乳香10 g、沒藥10 g、川芎10 g，加入10倍量水浸泡12 h后，煎煮2 h，濾過；加入8倍量水煎煮1 h，濾過；加入5倍量水，煎煮1 h，濾過，合并3次提取液，通過旋轉蒸發儀將其濃縮為浸膏，于4 ℃保存備用。經高效液相色譜檢測其主要有效成分芒柄花素、薯蕷皂苷、正丁烯基苯酚、黃芩苷的質量分數分別為4.298、3.568、1.779、18.634 mg/g。

2.2 活血榮絡方含藥血清的制備

雄性SD大鼠20只按照隨機數字表法隨機分為對照組和給藥組（生藥23.4 g/kg）。給藥組ig相應藥物，對照組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續7 d。于末次給藥1 h后，大鼠ip 10%水合氯醛（3 mg/kg）深度麻醉，暴露腹主動脈，使用負壓采血管采集全血5 mL至無抗凝劑的普通采血管中，靜置1 h，3000 r/min離心10 min，收集上清于離心管中，于56 ℃水浴滅活30 min，經0.22 μm濾膜濾過除菌，即為活血榮絡方含藥血清和對照血清，于?80 ℃保存備用。

2.3 bEnd.3細胞培養

bEnd.3細胞用含5% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，待融合度達到80%～90%時進行傳代。

2.4 活血榮絡方含藥血清對糖氧剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導bEnd.3細胞損傷模型細胞存活率的影響

取對數生長期的bEnd.3細胞，以1×104個/孔接種于96孔板中，另設調零孔（不接種細胞）。設置對照組、模型組和給藥組，對照組于正常條件下培養；模型組將培養基更換為DMEM無糖培養基，并將細胞置于37 ℃、5% CO2、95% N2、1% O2的三氣培養箱中培養6 h，隨后移出三氣培養箱，更換為完全培養基于普通培養箱中培養24 h；給藥組將培養基更換為DMEM無糖培養基，缺氧培養6 h，隨后移出三氣培養箱，分別加入5%、10%、15%、20%的活血榮絡方含藥血清，于普通培養箱中培養24 h。更換新鮮培養基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－調零)/(對照－調零)

2.5 染色質免疫共沉淀-測序分析（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）獲取轉錄因子Bmal1的DNA結合片段

以37%的甲醛溶液交聯固定培養瓶內bEnd.3細胞，培養瓶中加入甘氨酸室溫終止反應，用細胞刮刀刮取細胞，離心，使用細胞裂解液和ChIP緩沖液混合物充分裂解細胞；冰上超聲處理DNA片段，10 000 r/min離心5 min，取上清進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA長度（200 bp左右）；各取100 μL超聲產物置于2 mL EP管中并標記為IgG組、IP組和Input組，其余上清分裝后于?80 ℃保存。在各EP管中加入900 μL ChIP緩沖液，IP組加入5 μL Bmal1抗體，IgG組加入5 μL IgG血清，充分混勻后4 ℃孵育過夜；加入40 μL經過洗滌、魚精DNA封閉、TE洗滌的Protein G凝膠，于4 ℃混合器中孵育1～2 h，3000 r/min離心2 min沉淀凝膠，取上清暫存，留沉淀，依次用低鹽洗脫緩沖液、高鹽洗脫緩沖液和TE緩沖液沖洗，3000 r/min離心2 min后沉淀凝膠，吸取上清；每管加200 μL ChIP洗脫緩沖液，溫和渦旋，65 ℃孵育30 min，間隔5 min拿出溫和振蕩；每管加入NaCl解交聯；DNA產物純化回收，將回收的DNA進行高通量測序。

2.6 bEnd.3細胞慢病毒轉染及鑒定

bEnd.3細胞以5×104個/孔接種于6孔板中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。根據感染復數（MOI）＝30計算，使用10 μLsiRNA慢病毒載體轉染bEnd.3細胞，轉染24 h后，更換新鮮的DMEM培養基。72 h后加入含5 μg/mL嘌呤霉素的DMEM高糖培養基，繼續培養3 d后，通過熒光顯微鏡觀察細胞的轉染情況達到95%以上，最終得到si-Bmal1慢病毒轉染的bEnd.3細胞穩定株。

2.7 分組及給藥

設置對照組、模型組、活血榮絡方組、si-Bmal1組和si-Bmal1＋活血榮絡方組。對照組于正常條件下培養；模型組按“2.4”項下方法處理；活血榮絡方組將培養基更換為DMEM無糖培養基，缺氧培養6 h后，加入10%活血榮絡方含藥血清，于普通培養箱中培養24 h；si-Bmal1組在模型組基礎上進行si-Bmal1慢病毒轉染；si-Bmal1＋活血榮絡方組在si-Bmal1組基礎上加入10%活血榮絡方含藥血清干預24 h。

2.8 劃痕實驗檢測bEnd.3細胞遷移能力

用標記筆在6孔板背后劃5條間距均勻的橫線，以作參考。每孔加入2×105個細胞，細胞密度達到85%，用無血清培養基培養24 h進行周期同步化，用移液槍頭尖端劃過單層細胞，用PBS清洗脫落的細胞。按“2.7”項下方法進行分組及給藥，于顯微鏡下觀察并拍照，記錄0、24 h劃痕面積，計算劃痕愈合率。

劃痕愈合率＝(0 h劃痕面積－24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積

2.9 Transwell小室實驗檢測bEnd.3細胞遷移能力

將bEnd.3細胞以2×104個/孔接種到Transwell上腔室，按“2.7”項下方法進行分組及給藥，對照組、模型組和si-Bmal1組上、下室均添加含藥血清的DMEM無糖培養基，給藥組添加10%活血榮絡方含藥血清的DMEM無糖培養基。缺氧處理6 h后，將下室的培養基替換為600 μL含20% FBS的DMEM高糖培養基及質量濃度為20 μg/L的VEGF，于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育24 h后，去除殘留在上室膜表面的細胞。下室膜表面的bEnd.3細胞用4%甲醛固定，0.1%結晶紫染色。染色細胞拍照并在5個隨機鏡下計數，用Image J軟件進行定量。

2.10 Matrigel基質膠實驗檢測bEnd.3細胞管腔形成能力

將基質膠于4 ℃冰箱過夜融化，96孔板和200 μL槍頭在4 ℃冰箱預冷備用。于冰上以基質膠（50 μL/孔）包被96孔板，置于培養箱凝固60 min。取處于對數生長期的bEnd.3細胞，用含10%對照血清和活血榮絡方含藥血清的DMEM高糖培養基分別重懸細胞，以2×104個/孔接種至提前用基質膠包被的96孔板，缺氧培養6 h，于顯微鏡下觀察，拍照成管細胞，并隨機選取3個視野，用Image Pro Plus 6.0分析系統計數每孔4個隨機選定視野下分支點。

2.11 Western blotting檢測細胞中Bmal1、Clock、VEGF、MMP-2、Notch-1及DLL4蛋白表達

bEnd.3細胞接種于10 cm培養皿中，細胞融合度達到90%時，用無血清培養基培養24 h，缺氧處理6 h后，分別于4、8、12、16、20、24 h收集細胞，用以檢測生物鐘蛋白變化。藥物組則分別加入10%對照血清和活血榮絡方含藥血清作用24 h后收集細胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫搖床封閉2 h，分別加入Bmal1抗體（1∶2000）、Clock抗體（1∶400）、VEGF抗體（1∶2000）、MMP2抗體（1∶1000）、Notch1抗體（1∶1500）、DLL4抗體（1∶1500）和β-actin抗體（1∶8000），4 ℃孵育過夜；洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶8000），室溫搖床孵育2 h；洗膜后加入ECL超敏發光液，采用凝膠成像儀進行成像，運用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.12 免疫熒光檢測細胞中VEGF和Notch-1蛋白表達

取處于對數生長期的bEnd.3細胞，以5×103/孔接種于預先放置好爬片的24孔板中，當融合度達到20%～30%時，缺氧處理6 h，再給予10%活血榮絡方含藥血清正常處理24 h。棄去培養液，各孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min；PBS緩沖液潤洗細胞后，加入500 μL 0.25% TritonX-100破膜3 min；PBS緩沖液潤洗后，加入5%牛血清白蛋白，室溫封閉30 min；分別添加100 μL VEGF和Notch1抗體（1∶100），4 ℃過夜；PBS潤洗后，分別滴加100 μL驢抗兔IgG H&L抗體和Dylight 549標記的山羊抗兔IgG抗體和（1∶500），室溫避光孵育60 min；PBS緩沖液潤洗細胞，滴加DAPI，室溫避光孵育3～5 min；PBS緩沖液潤洗后，取載玻片，滴加10 μL抗熒光衰減封片劑，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.13 統計學方法

3 結果

3.1 OGD/R增加bEnd.3生物鐘蛋白Bmal1及Clock表達

首先對bEnd.3細胞進行周期同步化，糖氧剝奪6 h后復糖復氧，并在隨后的20 h內，每4小時提取蛋白，檢測生物鐘蛋白Bmal1與Clock表達變化。如圖1所示，復糖復氧4 h，生物鐘蛋白Bmal1與Clock表達無明顯變化，復糖復氧8 h二者表達量與對照組比較均明顯升高（＜0.05），復糖復氧12～20 h，Bmal1與Clock蛋白表達均顯著升高（＜0.001）。表明OGD/R損傷可使內皮細胞生物鐘發生改變，且呈不斷升高的趨勢，根據本研究結果，將糖氧剝奪6 h/復糖復氧12 h作為后續實驗方案。

3.2 Bmal1蛋白在內皮細胞中的生物學功能分析

生物鐘蛋白可調控分子功能，參與細胞增殖、遷移、分化等生物進程。Bmal1可促進血管新生，減輕缺氧缺氧損傷，但其在內皮細胞中的轉錄調控尚未報道，故借助ChIP-seq技術探究Bmal1在內皮細胞中的全基因組轉錄調控作用。使用特異性抗體Bmal1（IP級別）與DNA片段進行交聯形成復合物后發生免疫沉淀（圖2）。

A-對照組 B-4 h組 C-8 h組 D-12 h組 E-16 h組 F-20 h組 與對照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

解交聯后純化的DNA片段進行高通量測序，得到與蛋白質相結合的DNA序列信息，通過對該序列的長度和比對到該序列上的Pair and Read數來確定該序列對應的峰的相對豐度。圖3顯示Peak在基因組的不同功能區分布情況，結合啟動子-轉錄起始區（promotor-transcriptional start site region，promotor-TSS）達7.77%，圖4顯示在TSS上下游2000個bp所捕獲reads數。基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析獲得生物進程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）相關基因的分布（圖5），靶點涉及的BP條目主要富集在細胞發育、神經再生分化、細胞形態、調節細胞增殖等，靶點涉及的MF相關的條目主要富集在離子結合、小分子結合、轉移酶激活等，靶點涉及CC相關主要富集在胞質、質膜、細胞骨架、神經元細胞等。

圖2 Western blotting檢測bEnd.3細胞免疫共沉淀

圖3 Peak在基因組功能區的分布

圖4 Reads在轉錄起始位點(TSS區) 兩側的分布(n = 3)

圖5 Bmal1在內皮細胞潛在靶點GO功能富集分析

關聯分析（圖6）發現，Bmal1蛋白可以靶向結合小鼠腦微血管內皮細胞中血管新生關鍵基因，如17號染色體上基因的啟動子序列（位點46030452～46030695），2號染色體上基因的增強子序列（位點26463954～26464324），16號染色體上基因的啟動子序列（位點30066868～30067165、30065082～30065373、30064015～30064496）。

3.3 活血榮絡方含藥血清對OGD/R誘導bEnd.3細胞損傷模型細胞存活率的影響

為探索活血榮絡方對內皮細胞的保護作用及與生物節律聯系的作用機制，首先通過CCK-8檢測活血榮絡方含藥血清對OGD/R損傷內皮細胞的保護作用。如圖7所示，與對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，10%、15%活血榮絡方含藥血清組細胞存活率均顯著升高（＜0.01、0.001），且10%活血榮絡方含藥血清作用最佳。表明活血榮絡方含藥血清能減輕OGD/R誘導的bEnd.3細胞損傷，具有內皮細胞保護作用，故以10%含藥血清作為后續實驗濃度。

圖6 Reads在關聯基因VEGF、Notch1和HES1的分布情況(n = 3)

3.4 活血榮絡方含藥血清對OGD/R誘導bEnd.3細胞損傷模型遷移能力的影響

本課題組前期實驗表明，活血榮絡方可有效促進腦梗死大鼠血管新生，為探索活血榮絡方對內皮細胞的保護作用及與生物節律聯系的作用機制，利用RNA干擾技術，構建生物鐘基因敲降bEnd.3細胞穩轉株，用于體外驗證。于熒光顯微鏡下觀察慢病毒綠色熒光蛋白表達率，轉染效率達97%以上時，提取RNA及蛋白驗證的mRNA與蛋白敲降效率，如圖8所示，在3組siRNA中，siRNA2的敲降效率最佳，的mRNA及蛋白表達均下降50%左右，故將siRNA2穩轉株作為后續實驗細胞。

A-對照組 B-模型組 C-5% HXRL組 D-10% HXRL組 E-15% HXRL組 F-20% HXRL組 與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001

A-對照組 B-siRNA1沉默組 C-siRNA2沉默組 D-siRNA3沉默組 與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

利用劃痕、Transwell研究內皮細胞血管生成表型，如圖9所示，與對照組比較，模型組細胞遷移率顯著升高（＜0.01、0.001），表明OGD/R損傷促進bEnd.3細胞遷移；與模型組比較，si-Bmal1組細胞遷移率顯著降低（＜0.05、0.01），提示敲降后，細胞遷移能力受限；活血榮絡方可進一步提升bEnd.3細胞OGD/R損傷后的遷移能力（＜0.01、0.001），敲降細胞株中，活血榮絡方的促遷移能力受到限制（＜0.01、0.001）。

3.5 活血榮絡方含藥血清對OGD/R誘導bEnd.3細胞損傷模型成管能力的影響

管腔形成是評價內皮細胞血管新生能力的另一重要指標，利用成管實驗評價Bmal1與HXRL對bEnd.3細胞OGD/R損傷模型的影響。如圖10所示，與對照組比較，模型組血管分支總長度顯著增加（＜0.01），提示OGD/R損傷顯著促進bEnd.3細胞成管能力；與模型組比較，si-Bmal1組血管分支總長度明顯下降（＜0.01），表明敲降可降低bEnd.3細胞的管腔形成能力；活血榮絡方組血管分支總長度增加（＜0.05），敲降后，血管分支總長度則明顯下降（＜0.05），表明活血榮絡方具有促bEnd.3細胞OGD/R損傷后的管腔形成能力，而在敲降株中該促進作用被抑制。

3.6 活血榮絡方含藥血清對OGD/R誘導bEnd.3細胞損傷模型中生物鐘及血管新生關鍵蛋白表達的影響

VEGF及Notch1是內皮細胞參與血管新生的重要分子，Bmal1可調控上述關鍵分子的轉錄過程，采取免疫熒光法檢測各組細胞中VEGF及Notch1蛋白表達。如圖11所示，與對照組比較，模型組VEGF及Notch1蛋白表達水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，si-Bmal1組VRGF及Notch1蛋白表達水平顯著下降（＜0.01、0.001）；活血榮絡方含藥血清可進一步上調VEGF及Notch1蛋白表達水平（＜0.001），敲降后，VEGF及Notch1蛋白表達水平顯著下降（＜0.01、0.001）。

A-對照組 B-模型組 C-HXRL組 D-si-Bmal1組 E-si-Bmal1+HXRL組 與對照組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與HXRL組比較：&P＜0.05 &&P＜0.01 &&&P＜0.001；與si-Bmal1組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖10 Bmal1及活血榮絡方對bEnd.3細胞成管能力的影響(, n = 3)

Western blotting檢測結果見圖12、13，與對照組比較，模型組Clock、Bmal1、NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）；給予活血榮絡方含藥血清干預后，Clock、Bmal1、NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表達水平進一步升高（＜0.05、0.01、0.001），敲降后，NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

圖11 Bmal1及活血榮絡方對bEnd.3細胞內VEGF和Notch1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖12 活血榮絡方對bEnd.3細胞Clock和Bmal1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖13 Bmal1及活血榮絡方對bEnd.3細胞NICD、DLL4、MMP2及VEGF蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

腦梗死的損害主要來源于血液灌注不足引起的持續缺氧損傷，側支循環作為重要的保護補償機制，可通過增加血液灌注，恢復氧供，改善ICS的預后[16]。血管新生屬于三級側支循環，由現有的血管中分離形式微血管網絡，向發生在邊界區的受影響區域提供氧氣和營養物質，是應對腦梗死的關鍵保護機制[17-18]。研究表明，在腦梗死患者和動物模型中，血管生成可通過促進組織修復、血管重塑、改善缺血周圍組織灌流，從而促進神經功能恢復[19-21]。因此，促進缺血后血管生成是臨床治療腦梗死的關鍵目標之一[5,21-23]。

哺乳動物的晝夜節律系統由中樞下丘腦視交叉上核和外周器官（包括血管、心臟等器官）中的晝夜節律振蕩器組成。這些振蕩器通過多個生物鐘基因（包括、、、家族基因）的轉錄/翻譯反饋回路產生細胞自主節律。這種多振蕩器系統在所有生理系統（包括心血管、代謝、免疫和炎癥功能）中產生內源性晝夜節律，該網絡的破壞會導致內部不同步和晝夜節律紊亂，促進疾病發生發展[24-25]。研究發現，晝夜節律紊亂可升高ICS發病率，與高密度脂蛋白膽固醇水平降低、三酰甘油水平升高、皮質醇節律紊亂、C反應蛋白升高、血壓升高、胰島素敏感性降低和葡萄糖水平升高的糖尿病前期狀態密切相關[10,26-29]。此外，晝夜節律紊亂可增加ICS梗死面積，加重免疫炎癥反應，損傷內皮功能[11,30]。晝夜節律不僅是ICS的獨立危險因素，在ICS后的血管新生進程中，同樣發揮著不可替代的作用。研究表明，生物鐘蛋白調控促血管生成因子的分泌、基底膜（basement membrane，BM）降解、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）重塑及內皮細胞增殖遷移。?∕?小鼠中MMPs家族蛋白表達升高，進而促進BM降解與ECM重塑[31]。過表達可通過調控VEGF啟動子活性，上調VEGF蛋白表達，促進缺血缺氧損傷的內皮細胞的血管生成能力，敲降表達可逆轉Bmal1的促血管新生作用[13]。綜上，晝夜節律影響著腦梗死發生、發展及預后，其關鍵分子在腦梗死后的血管新生發揮不可替代的作用。

晝夜節律與祖國醫學中的陰陽平衡理論高度契合。自然界的晝夜變化之間，陰陽在不斷地進行節律性的交替轉化，人體的生理活動隨著晝夜變化發生相應變化，影響著人體內的陰陽平衡[32]。《雜病廣要》記載：“夫中風者，皆因陰陽不調，臟腑氣偏，榮衛失度”，指出陰陽失衡是腦梗死發生的根本，恢復臟腑功能、調節榮衛之司為診治腦卒中的關鍵。其中精、血、津液屬陰，氣屬陽，“陰在內，陽之守也；陽在外，陰之使也”，即達到人體陰陽動態平衡，故陰陽平衡理論對診治腦梗死具有較高的臨床指導意義。本課題組根據多年的臨床實踐與理論探索，在腦藏象理論的指導下，提出榮氣為精、氣、血、津液等精微物質的總稱，各種成分相互依存、平衡轉化，是維持生命健康的重要條件[14]。當腦梗死疾病發生后，陰陽失調，榮氣虛滯，精微物質匱乏致滋養不足，榮氣之榮養、化變、成形功能障礙，新生血管受限[33]。基于陰陽理論及榮氣理論，創制具有調和陰陽、養陰生津、活血養血等功效的活血榮絡方，該方為湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，納入臨床路徑達13年。本課題組前期研究發現，活血榮絡方可上調VEGF、Kruppel樣因子4（kruppel-like factor 4，KLF4）、微囊蛋白-1（caveolin-1，CAV-1）表達，下調MMP9表達，激活Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，減輕腦梗死急性期炎性反應，增加MVD，促進血管新生，改善腦梗死后神經功能缺損癥狀[15]。

本研究結果表明，活血榮絡方具有促進OGD/R損傷的bEnd.3細胞的血管新生能力，且該促進作用依賴于對生物鐘蛋白Bmal1的調控。首先，bEnd.3細胞受到OGD/R損傷后，生物鐘蛋白Bmal1及Clock的表達隨時間延長而升高，表達量于12～20 h顯著升高，提示二者可能在OGD/R損傷的內皮細胞中發揮保護作用，故利用ChIP-seq探究Bmal1在內皮細胞中全基因組的調控功能，發現Bmal1參與細胞發育、神經再生分化、細胞形態、細胞增殖等生物進程，并與血管新生關鍵分子VEGF、Notch1等啟動子區靶向結合，可作為轉錄激活因子，直接調節生長因子的表達，表明Bmal1可能在OGD/R損傷后的血管新生進程中扮演著不可或缺的角色。既往研究表明，?∕?小鼠的后肢在缺血缺氧損傷后，其血管生成能力顯著下降，VEGF表達降低，過表達則可明顯促進人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的遷移和成管能力[13]。為此，進一步構建bEnd.3細胞敲降株，以探究Bmal1及活血榮絡方含藥血清對OGD/R損傷的bEnd.3細胞血管生成能力的影響。結果顯示，敲降的bEnd.3細胞在受到OGD/R損傷后，遷移能力及成管能力下降。同時，活血榮絡方表現出了有效的促內皮細胞遷移及成管的能力，但此促進作用在敲降株中被逆轉，提示活血榮絡方的促血管新生作用可能依賴于對Bmal1的調控。

Western blotting結果顯示，OGD/R損傷可顯著升高bEnd.3細胞中生物鐘蛋白Bmal1及Clock表達，活血榮絡方進一步升高二者蛋白表達，提示具有調和陰陽的活血榮絡方在調節OGD/R損傷后生物節律的過程中，發揮有效且顯著的效果。免疫熒光及Western blotting結果表明，活血榮絡方同樣可進一步升高血管新生關鍵分子NICD、DLL4、MMP2及VEGF的蛋白表達，發揮促進血管新生的作用，但該促進效果在基因敲降的bEnd.3細胞株中收到抑制，可見活血榮絡方的促血管新生作用依賴于對生物節律的調控。

生物節律調節哺乳動物生理和病理的大部分過程。大量的研究表明生物節律和血管生成相互作用，共同影響腦梗死后缺血缺氧損傷的恢復。綜上，當內皮細胞受到缺血缺氧損傷后陰陽失衡，榮氣中精微物質的消長轉化受限，而活血榮絡方能夠有效通過調和陰陽，改善其生物節律，促進內皮細胞榮氣之榮養、化變、成形功能。本研究為進一步中醫藥防治缺血性腦卒中提供了實驗基礎，豐富現代科學內涵。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Huoxue Rongluo Recipe on regulating circadian clock protein Bmal1 to improve angiogenesis in bEnd.3 cells after oxygen-glucose deprivation/ reperfusion injury

ZHANG Yu-xing1, ZHANG Ying1, ZENG Fu-kang1, GUOChun2, GAO Xiao-feng2, LI Zhong2, CHEN Yao2, ZHOU De-sheng2,LIU Li-juan2

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410000, China 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410000, China

To explore the mechanism of Huoxue Rongluo Recipe (活血榮絡方, HXRL) on promoting endothelial cells angiogenesis via regulating circadian protein brain and muscle arnt-like 1 (Bmal1) based on the theory of yin-yang and the effect of HXRL on angiogenesis after cerebral infarction.Western blotting was used to detect the expressions of circadian proteins Bmal1 and Clock at each time point after bEnd.3 cells were injured by oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R). Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) was used to determine the role of Bmal1 in genome wide, and its effects on bEnd.3 cell biological process, cell component and molecular function. The optimal intervention concentration of HXRL containing serum was detected by CCK-8 method.gene was knocked down in bEnd.3 cells and divided into control group, model group, HXRL containing serum group, si-Bmal1 and si-Bmal1 + HXRL containing serum group. The expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and neurogenic locus notch homolog protein 1 (Notch1) were detected by immunofluorescence. Western blotting was used to detect VEGF, matrix metalloproteinases 2 (MMP2), Notch1 intracellular domain (NICD) and delta-like protein 4 (DLL4) protein expressions.After bEnd.3 cells were injured by OGD/R, the expressions of Bmal1 and Clock proteins were gradually increased, and there were significant differences at 8, 12, 16 and 20 h points after modeling (< 0.05, 0.001). ChIP-seq suggests that Bmal1 was involved in cell development, differentiation, proliferation, and other processes in endothelial cells, and targeted the transcriptional start site region of VEGF and Notch1. The results of CCK-8 experiment showed that after bEnd.3 cells were injured by OGD/R, 10% HXRL-containing serum could effectively improve cell viability (< 0.001). Scratch, migration and tube formation experiments confirmed that HXRL-containing serum could effectively improve the migration ability and angiogenesis ability of bEnd.3 cells after OGD/R injury (< 0.05, 0.01, 0.001), but inknockdown strains, this promotion was suppressed (< 0.05, 0.01, 0.001). The results of immunofluorescence and Western blotting showed that HXRL-containing serum could further increase the protein expressions of VEGF, MMP2, NICD, DLL4, Bmal1 and Clock in bEnd.3 cells damaged by OGD/R (< 0.05, 0.01, 0.001). Inknockdown strain, the promoting effect of HXRL-containing serum on the expressions of VEGF, MMP2, NICD and DLL4 was inhibited (< 0.05, 0.01, 0.001).HXRL can effectively promote the angiogenesis of endothelial cells after OGD/R injury, and its mechanism is closely related to the regulation of circadian clock Bmal1 protein.

Huoxue Rongluo Recipe;ischemic stroke; circadian clock protein Bmal1; oxygen-glucose deprivation; Bmal1 knockdown strain; angiogenesis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6509 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.023

2022-06-16

國家自然科學基金資助項目（82104766）；湖南省自然科學基金資助項目（2021JJ30521，2021JJ40424）；湖南省衛健委科研項目（202103071190）；湖南省中醫藥管理局資助項目（2021218）；湖南中醫藥大學中西醫結合一流學科開放基金資助項目（2020ZXYJH38，2020ZXYJH39）；湖南中醫藥大學校級科研基金與聯合基金項目（2021XJJJ039，2021XJJJ052）

張宇星，男，博士，從事中醫藥對腦血管病及其并發癥的防治研究。Tel: 15616213284 E-mail: yuxing-zhang@foxmail.com

周德生，男，博士，主任醫師，從事中醫藥對腦血管病及其并發癥的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 2478020529@qq.com

劉利娟，女，博士，副主任醫師，從事中醫藥對腦血管病及其并發癥的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 601264967@qq.com

[責任編輯 李亞楠]