高內涵無熒光標記活細胞成像技術的建立及應用

楊 晨，劉雙雙，洪曉黎，畢 超，邱淑兵

（1.浙江大學醫學院附屬口腔醫院·浙江大學口腔醫學院·浙江省口腔疾病臨床醫學研究中心·浙江省口腔生物醫學研究重點實驗室·浙江大學癌癥研究院，浙江 杭州 310000；2.浙江大學醫學院公共技術平臺，浙江 杭州 310058）

目前高內涵篩選技術作為一種成熟的自動顯微成像技術，將高通量自動成像和分析結合起來，來獲得單細胞水平的多參數定量化數據，涉及腫瘤治療[1]、藥物篩選[2]、毒理學[3]、細胞表型研究[4]、細胞信號通路研究[5]、活細胞生物學功能研究[6]等。隨著單細胞水平研究的不斷深入，高內涵成像以其自身具備的高通量自動成像、數據信息量大、智能化的定量化分析等優勢，越來越受到各位研究人員的認可。DPC 可對無熒光染色的活細胞樣品成像，在保證細胞結構和功能的完整性同時，通過單次試驗就可以獲得大量的細胞學數據。本文將就高內涵成像的DPC 模塊展開介紹與成像方法詳細分享，主要包括實驗前樣本的準備、成像參數的設置與成像過程中的注意事項以及實驗數據的定量化分析等方面，旨在為從事細胞增殖和遷移等研究的學者們提供一種高效的實驗方法與技術手段。

1 DPC 成像前的準備

1.1 細胞準備要求

細胞不需要進行任何的熒光染色，單層的貼壁細胞且狀態好，細胞匯合率在60%～80%左右比較合適。懸浮細胞樣品，可將微孔板進行包被，或采用低速離心的辦法制備樣品。本文分享的案例[7]是人結腸癌細胞HCT116 和LoVo，分為control 和miR-30b-5p 兩組，按照2×104個細胞/孔的密度接種到96 孔板，匯合度在80%，滿足高內涵DPC 成像的條件。

1.2 微孔板選擇

實驗選擇的是PS（聚苯乙烯）材質的96 微孔板（Corning 3599），可以滿足DPC 成像的需要。另外，也可以選擇Perkin Elmer 開發的專用96 微孔板（CellCarrier Ultra microplates）或者Special Optics 96孔板（貨號Corning 3603，美國）等。該板的底部比PS孔板的底部薄，透明的底部能降低背景熒光，成像效果會更好。

1.3 成像模式的選擇

成像模式選擇的是寬場模式，長時間高強度曝光會對細胞造成光毒性，所以活細胞成像也更適合使用寬場成像模式，而且應該選擇盡量低的激發能量和較短的曝光時間。

1.4 物鏡選擇

普通多孔板適合于20 X 物鏡及以下鏡頭，不需要觀察共聚焦亞細胞結構或紋理分布，一般選擇10 X 物鏡拍攝，視野大，拍攝時間相對短。

1.5 儀器要求

高內涵細胞成像與分析系統需要配備溫度和CO2控制模塊（Temperature and CO2，TCO），能夠提供活細胞長時間培養所需的溫度和二氧化碳，本文使用儀器型號為Operetta（Perkin Elmer，美國）。細胞對環境要求高，需要至少提前半小時開啟TCO。

1.6 數據分析

使用儀器自帶的Harmony 4.1 軟件，可以自行創建分析算法，也可以使用儀器的自學習功能，訓練軟件自動識別特定細胞，對細胞進行分組，并進行運動軌跡、位移、方向、速度等多種參數分析，實現分析結果的可視化。

2 DPC 成像技術的建立

利用Operetta 的TCO 模塊提供細胞長時間培養所需的溫度和二氧化碳，將96 孔板放置在活細胞工作站，在10 X 物鏡下使用DPC 成像功能進行拍攝觀察細胞的遷移情況。分享案例中成像使用的是Time series 即時間序列，拍攝條件設置如下：Emission：50%，Time：12 ms，Height：-2 μm，Mode：High contrast，Interval：25 min，38 個時間點，總共拍攝時長近16 h。

3 實驗結果與數據分析

3.1 成像結果

圖1 是利用DPC 成像技術得到的人結腸癌細胞HCT116 和LoVo，control 和miR-30b-5p 兩組共四組細胞的成像數據（圖片為任意選取，僅作結果展示），可以獲取到所有選定孔內選定視野內每個細胞在T0-T37 共38 個時間點，近16 h 拍攝時長的實驗數據，獲得的成像圖像信噪比高，有利于下一步正確識別細胞進行圖像分割。

圖1 四組細胞DPC 成像示例圖

3.2 整個實驗的流程圖建立

對整個實驗前期準備、實驗開展以及數據分析做了流程的梳理，見圖2。在樣品準備階段，細胞狀態良好且貼壁，匯合度在80%左右。在樣品成像階段，一般在10 X 物鏡下，選取寬場模式，設置好低曝光成像條件，拍攝時間序列，獲得高質量的圖像數據。在數據分析階段，可以正確識別細胞，做好圖像分割，最終實現實驗數據的可視化。

圖2 高內涵活細胞追蹤成像和分析的流程圖

3.3 分析算法的建立

拍攝結束后，利用高內涵強大的Image Analysis即數據分析功能，追蹤到每個細胞，并建立數據分析的流程圖，見圖3。

圖3 Image Analysis 的流程圖

可以清晰地看出，依次經過Find cells、Track objects、Calculate Intesity Properites、Calculate Morphology Properites、Calculate Kinetic Properites 和 Calculate Track Properites 共六步的分析，可以獲得細胞的各類參數，包括移動速度（Current Speed）、移動步徑（Current Step）、在X 軸 上 的 移 動 距 離（Current Displacement X（μm））、在Y 軸上的移動距離（Current Displacement Y（μm））等。

3.4 批量數據的結果分析

分析算法建好之后，進一步利用Evaluation 模塊，對整板數據進行批量運算，得到所有拍攝孔的數據。其中，如圖4 分享的案例數據，其中橫軸為Current Displacement X（μm），縱軸為Current Displacement Y（μm），表明細胞分別在X 和Y 軸上的移動距離。也可以根據實驗分組和處理不同，進一步繪制柱狀圖，進行組間差異的比較，更為直觀。

圖4 四組細胞的移動距離示例圖[7]

4 結論

本文分享的案例研究[7]采用96 孔板接種細胞，不需要做任何的熒光標記，以無標記貼壁活細胞為成像對象，統計視野內每個活細胞的遷移情況。研究中采用的數據分析方法，用時可以控制在2 h 以內，與傳統的MTT 和CCK-8 方法相比較，實驗時間明顯減少、實驗效率顯著提高、通量高、可追蹤、數據代表性好，分析得到的定量化數據更有說服力。MTT 和CCK-8的檢測方法一般通過酶標儀測定樣本的吸光度，沒辦法直接觀察到細胞的生長情況，也不能做到定量化分析[8，9]。

圖像分割是數據分析的重要步驟，如果分析軟件不能很好地分割識別出每一個細胞或者要分析的個體，得到的分析結果也是不夠準確的[10]。這就對成像的樣品提出了一定的要求，細胞需要為單層的貼壁細胞且狀態好，細胞匯合率在80%左右比較合適。細胞生長過快或者過密，可適當降低接種密度，可在50%～80%范圍之間摸索。如果遇到確實特殊的細胞樣品，細胞本身就很容易結團，能做的只有盡量優化成像條件，找到適合視野內所有細胞分割的條件。所以，樣品制備的質量，關系著數據分析的結果好壞，至關重要。

選擇合適的微孔板是高內涵實驗成功的重要因素。常規微孔板底材質為玻璃、聚丙乙烯（PE）、烯烴（CO），對于絕大部分實驗來說，建議使用TC-Treated PS 或CO板，TC-Treated PS 板以及CO 板都能夠粘附蛋白，從而促進細胞的貼壁。玻璃底板的透光度更好，但是不適合細胞培養，如果需要使用一般可以通過包被不同的生物分子來提高細胞的貼壁以及改善細胞的生長特性。微孔板的厚度是影響透光性以及成像質量的重要因素。板底厚度在250 μm 以上的，需要長工作距離鏡頭，并且需要調整矯正環，不推薦板底厚度大于1 mm 的微孔板。如需要觀察共聚焦亞細胞結構或紋理分布，必須用推薦薄底板。

DPC 成像，對細胞無干預，能最大限度保證細胞狀態，利用近紅外波長檢測，最大限度地降低了光毒性和光損傷，所以特別適合長時間動態觀察。DPC 成像具有通量高、樣本制備方便、數據分析簡便等明顯優勢，相信能夠為開展活細胞相關研究的科研工作者們提供技術借鑒。