瑞香素對坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用及其機(jī)制*

張 奕，賈蔓箐，劉園園，劉 軍

（新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830028）

神經(jīng)病理性疼痛（NP）是一種由體感神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙引起的以痛覺超敏、痛覺過敏、自發(fā)性疼痛和感覺異常為特征的慢性疼痛。據(jù)統(tǒng)計，NP 在成年人中的患病率為7%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。NP的病因復(fù)雜，其診斷和治療仍是目前臨床面臨的難題[2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的偶聯(lián)改變在NP的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[3]。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可能通過促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子釋放誘發(fā)局部神經(jīng)炎癥，使神經(jīng)元致敏，從而促進(jìn)NP的產(chǎn)生[4]。而阻斷促炎趨化因子的分泌或維持促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子的平衡能夠減輕疼痛超敏反應(yīng)[5]。以上研究結(jié)果提示，活化的膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)可能是NP的重要發(fā)病機(jī)制之一。

瑞香素（DAPH）是從瑞香中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等廣泛的生物活性，已被臨床用于治療炎癥性疾病[6]。動物實(shí)驗(yàn)表明，DAPH 對伴有慢性疼痛的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎均具有良好的改善作用[7-8]。此外，DAPH 透皮貼片可減輕醋酸誘導(dǎo)的小鼠疼痛[9]。然而，DAPH 的鎮(zhèn)痛作用，尤其在慢性炎性疼痛方面的作用及其機(jī)制尚未明確。基于此，本研究通過采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（CCI）誘導(dǎo)大鼠NP，探索DAPH在慢性炎性疼痛中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級SD 雄性大鼠60 只，8～10 周齡，體重250～280 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK（新）2018-0002。動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 DAPH（純度≥98%，規(guī)格：20 mg）購自成都艾博克生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、ECL 均購自合肥萊爾生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒購自武漢艾迪抗生物科技有限公司；鼠抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體、鼠抗鈣離子接頭蛋白1（Iba-1）單克隆抗體均購自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）單克隆抗體、兔抗Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）單克隆抗體、兔抗凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）單克隆抗體、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）單克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的抗鼠IgG 和抗兔IgG 抗體均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

BW-EVF2393型電子Von Frey測痛儀購自上海阮隆科技發(fā)展有限公司；BME-410C 型全自動足底鎮(zhèn)痛測試儀購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CX43熒光顯微鏡購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司；SuPerMax 3100 型多功能酶標(biāo)儀購自上海閃譜生物科技公司。

1.3 NP大鼠模型的建立[10]腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉并固定大鼠，用止血鉗鈍性分離股二頭肌暴露坐骨神經(jīng)，采用4-0 鉻制羊腸線在坐骨神經(jīng)主干中部進(jìn)行4 圈環(huán)形結(jié)扎，每圈結(jié)扎間隔1 mm 的距離，術(shù)畢逐層縫合傷口，并腹腔注射100 mg/mL氨芐青霉素預(yù)防感染。若大鼠患肢足趾并攏且呈輕度外翻，出現(xiàn)蜷縮、跛行、自發(fā)性抬足等現(xiàn)象，機(jī)械縮足反射閾值（MWT）明顯降低，縮足反射潛伏期（TWL）明顯縮短，即說明CCI 誘導(dǎo)的NP大鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、DAPH低劑量組（DAPH-L組）、DAPH高劑量組（DAPH-H 組），每組15 只。模型組、DAPH-L 組、DAPH-H 組均建立NP 模型，假手術(shù)組手術(shù)操作同模型組但不結(jié)扎坐骨神經(jīng)。DAPH-L組和DAPH-H 組分別灌胃給予30 mg/kg 和90 mg/kg的DAPH[11]，假手術(shù)組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。術(shù)后第1天開始給藥，連續(xù)14 d。

1.5 大鼠疼痛行為測定 分別于術(shù)前1 d 和術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d進(jìn)行MWT和TWL測試。（1）MWT測試：將大鼠置于有機(jī)玻璃室內(nèi)30 min以適應(yīng)測試環(huán)境，隨后用不同壓力的von Frey 纖維絲刺激大鼠患肢足底中部，刺激強(qiáng)度由小到大，每種強(qiáng)度刺激重復(fù)5 次，每次刺激保持3～5 s，每兩次刺激間隔時間為30 s。記錄誘發(fā)大鼠縮足反應(yīng)≥3 次時的壓力值，記為陽性反應(yīng)。MWT 測試重復(fù)10 次，取平均值。（2）TWL測試：使用全自動足底鎮(zhèn)痛測試儀測量大鼠足底對熱刺激的敏感性。將大鼠置于3 mm厚的玻璃板表面，玻璃板上覆蓋有機(jī)玻璃室，輻射熱源位于玻璃板下方固定距離處，熱刺激直接作用于左后爪的暴露部位，記錄誘發(fā)大鼠頻繁抬足、舔足等現(xiàn)象的時間。測試儀切斷時間設(shè)置為30 s，以避免組織損傷。每隔5 min 進(jìn)行5 次熱刺激，取平均值。

1.6 標(biāo)本采集 疼痛行為測試結(jié)束后，麻醉大鼠，經(jīng)心臟灌注生理鹽水，分離大鼠L5 背根神經(jīng)節(jié)（DRG）組織和L4～L6節(jié)段之間的脊髓組織，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 ELISA法檢測大鼠脊髓組織中炎癥因子水平 取大鼠L4～L6 段脊髓組織，加入預(yù)冷的PBS，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.8 免疫熒光染色法檢測大鼠脊髓組織中GFAP和Iba-1 表達(dá)水平 取大鼠脊髓組織，置于4%多聚甲醛中，4 ℃冰箱固定過夜，30%蔗糖溶液脫水，取組織制備16 μm厚的冰凍切片，PBS漂洗3次，每次5 min。加入含有0.3%Triton X-100的5%山羊血清封閉液，室溫封閉2 h，清除血清，加入一抗GFAP（1∶1 000）、Iba-1（1∶1 000）稀釋液4 ℃冰箱孵育過夜，PBS 漂洗3 次，每次5 min；滴加二抗，室溫避光孵育2 h，DAPI 染色，PBS 充分漂洗，滴加抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J圖像分析軟件分析GFAP和Iba-1的熒光強(qiáng)度。

1.9 Western blotting 法檢測TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá) 取大鼠DRG 組織，加入RIPA裂解緩，冰上裂解，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。用10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h；加入一抗TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、β-actin（均1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，ECL顯影，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及體重變化 各組大鼠術(shù)后均未感染，切口愈合良好，精神狀況佳，飲水、進(jìn)食正常，體重?zé)o明顯差異（P＞0.05），見圖1。模型組、DAPH-L 組、DAPH-H 組大鼠術(shù)后1～3 d 出現(xiàn)跛行、左后肢負(fù)重困難等現(xiàn)象，在術(shù)后3～14 d 表現(xiàn)明顯。

圖1 各組大鼠體重變化

2.2 各組大鼠MWT 和TWL 比較 術(shù)前1 d，各組MWT和TWL比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d，與假手術(shù)組比較，模型組MWT 和TWL 降低（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組 和DAPH-H 組 術(shù) 后3 d、7 d、14 d 時MWT 和TWL 升高，且DAPH-H 組高于DAPH-L 組（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠MWT和TWL比較

2.3 各組大鼠脊髓組織中炎癥因子水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組和DAPH-H 組大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低，且DAPH-H組低于DAPH-L組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織中炎癥因子水平比較pg/mL，

表1 各組大鼠脊髓組織中炎癥因子水平比較pg/mL，

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與DAPH-L組比較，&P＜0.05。

2.4 各組大鼠脊髓組織中GFAP 和Iba-1 表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脊髓組織中GFAP 和Iba-1 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，GFAP 和Iba-1 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組和DAPH-H組大鼠脊髓組織中GFAP和Iba-1熒光強(qiáng)度減弱，GFAP和Iba-1表達(dá)水平降低，且DAPH-H組低于DAPH-L組（均P＜0.05），見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測大鼠脊髓組織中GFAP和Iba-1表達(dá)（×200）

2.5 各組大鼠DRG 中TXNIP、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠DRG中TXNIP、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組和DAPH-H 組大鼠DRG 中TXNIP、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達(dá)水平降低，且DAPH-H 組低于DAPH-L組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠DRG中TXNIP、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)比較

3 討論

DAPH 是一種天然香豆素衍生物，在心血管疾病、炎癥性疾病的治療中有著良好的效果[12]。Qi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，DAPH 可通過調(diào)節(jié)MAPK 信號通路和HSP70 表達(dá)保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。Zhi等[14]報道，DAPH通過激活海馬神經(jīng)元Nrf2/HO-1信號通路保護(hù)海馬神經(jīng)元免受氧氣葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的損傷。DAPH 可通過抑制炎癥反應(yīng)、單胺氧化酶A 介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)損耗和氧化應(yīng)激減輕利血平所致小鼠纖維肌痛[15]。DAPH 還可通過調(diào)控Nrf2/HO-1/NF-κB 信號通路抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而減輕弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的炎性疼痛[16]。NP 屬于慢性炎癥性疼痛。本研究中，CCI誘導(dǎo)的NP大鼠術(shù)后出現(xiàn)明顯的機(jī)械超敏反應(yīng)和熱超敏反應(yīng)，經(jīng)DAPH干預(yù)后，NP大鼠機(jī)械超敏反應(yīng)和熱超敏反應(yīng)明顯減輕，且DAPH 高劑量改善大鼠疼痛效果顯著優(yōu)于DAPH低劑量。證實(shí)DAPH能夠有效改善NP，且其作用效果與藥物劑量相關(guān)。

周圍神經(jīng)損傷激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等釋放增多，從而啟動病理疼痛過程[17-18]。Iba-1 是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的特定標(biāo)志物，GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的生物標(biāo)志物，抑制Iba-1和GFAP表達(dá)可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。CCI可引起脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，促進(jìn)Iba-1 和GFAP 過度表達(dá)，抑制脊髓背角中Iba-1 和GFAP 的過度表達(dá)可緩解CCI 誘導(dǎo)的NP[19]。TNF-α在促進(jìn)神經(jīng)性疼痛的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，在周圍神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛模型中，DRG和脊髓背角中TNF-α表達(dá)上調(diào)，阻斷TNF-α信號可減輕硼替佐米誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛[20]。IL-1β 是疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，其由活化的巨噬細(xì)胞以原蛋白的形式表達(dá)，經(jīng)Caspase-1 蛋白水解生成成熟片段。IL-1β 成熟片段能夠引起初級感覺神經(jīng)元的神經(jīng)纖維敏感，進(jìn)而引起疼痛超敏。抑制IL-1β 表達(dá)可減輕CFA誘導(dǎo)的炎性疼痛[21]。IL-6也與多種病因引起的NP有關(guān)。紅核中IL-6通過激活JAK/STAT3和ERK信號通路參與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的NP，并通過誘導(dǎo)TNF-α 和IL-1β 產(chǎn)生維持NP[22]。本研究結(jié)果顯示，CCI 誘導(dǎo)的NP 大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及GFAP、Iba-1表達(dá)水平均升高，DAPH干預(yù)后NP 大鼠脊髓組織中促炎細(xì)胞因子及GFAP 和Iba-1 表達(dá)水平均明顯降低。表明DAPH 能夠抑制CCI 誘導(dǎo)的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，并減少大鼠脊髓促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生。

TXNIP廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞中，是內(nèi)源性清除活性氧的蛋白硫氧還蛋白的抑制劑，也是調(diào)節(jié)能量代謝過程中氧化應(yīng)激和炎癥的重要分子營養(yǎng)傳感器，其與脊髓或腦損傷、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)[23]。NLRP3 炎性小體在先天免疫和炎癥中起著至關(guān)重要的作用，NLRP3可通過ASC募集Caspase-1前體，活化Caspase-1，誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)。NLRP3的激活受多種細(xì)胞蛋白或因子的影響。TXNIP 與NLRP3 結(jié)合是NLRP3 炎性小體形成和激活所必需的關(guān)鍵信號機(jī)制。TXNIP/NLRP3 炎性小體軸已被證實(shí)在海馬損傷、腦缺血卒中、脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙或疾病中發(fā)揮重要作用[24-25]。Hu等[26]報道，抑制TXNIP/NLRP3炎性小體軸的激活能夠減輕CCI 引起的脊髓背角神經(jīng)元丟失，從而減輕CCI 誘導(dǎo)的NP。本研究結(jié)果顯示，CCI 誘導(dǎo)的NP大鼠DRG 中TXNIP 蛋白表達(dá)水平升高，TXNIP 通過與NLRP3 形成復(fù)合體激活NLRP3 炎性小體，促進(jìn)ASC 和Caspase-1 蛋白表達(dá)，而DAPH 能夠顯著下調(diào)NP 大鼠DRG 中TXNIP、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達(dá)。提示DAPH 改善CCI 誘導(dǎo)的NP，可能與抑制TXNIP/NLRP3炎性小體軸激活有關(guān)。

綜上所述，DAPH 通過阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕周圍神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的NP，其作用機(jī)制可能與抑制TXNIP/NLRP3炎性小體軸的活化有關(guān)。