氣相色譜-熱能分析儀法同時測定食品接觸材料及制品中15種N-亞硝胺在酒精類食品模擬物中的遷移量

林 睿, 徐敦明, 黃旖玨, 董清木, 賴 鶯, 楊子禾, 楊 澤, 莊麗麗, 郭思立, 吳易峰, 林偉靖, 林海霞, 丁華軍, 沈露虹, 涂星朋

（廈門海關技術中心, 福建 廈門 361026）

N-亞硝胺具有肝毒性和致癌性, 為強致癌物, 是國際公認毒性較大的污染物。吸煙是人群N-亞硝胺暴露的主要途徑, 對于非吸煙人群, 膳食和食品接觸材料遷移則是主要暴露途徑, 其它來源有內源性合成如胃中亞硝酸鹽與胺的反應等。食品接觸材料中亞硝胺類化合物的遷移不容忽視。以橡膠為例, 絕大多數的橡膠制品均通過高溫硫化最終成型, 該過程中發生硫化反應主要是硫化劑和硫化促進劑。其中, 以仲胺為基礎的硫化促進劑和硫磺給予體分解出仲胺, 并與空氣或配合劑中的氮氧化合物（NOx）在酸性條件下生成穩定的N-亞硝胺類化合物。與食品接觸的橡膠制品廣泛用于人們的日常生活中, 如：橡膠類食品接觸材料及制品、橡膠奶嘴、安撫奶嘴等。

我國及歐盟針對食品接觸材料及制品中N-亞硝胺類化合物的限量主要有：HG/T 2946-2011《橡膠奶頭》[1］、GB 28482-2012《嬰幼兒安撫奶嘴安全要求》[2］、GB 4806. 2-2015《食品安全國家標準奶嘴》[3］、EN 12868-2017[4］, 規定奶嘴及安撫奶嘴中N-亞硝胺類化合物釋放量不超過0. 01 mg/kg, N-亞硝胺可生成物釋放量不超過0. 1 mg/kg；國標GB 4806. 11[5］《食品安全國家標準食品接觸用橡膠材料及制品》征求意見稿, 增加了N-亞硝胺和N-亞硝胺可生成物遷移量的限量, 但尚無配套的測定方法。

目前, 測定N-亞硝胺類化合物的主要方法有氣相色譜-熱能分析法（GC-TEA）[2-3］、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[6-8］、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）[9-12］、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[13］。其中GC-TEA法具有靈敏度高（介于GC-MS法和GC-MS/MS之間）、對N-亞硝胺類化合物選擇性強、基質干擾小等優點, 被歐盟、美國廣泛應用于N-亞硝胺類化合物的測定。目前對食品接觸材料中N-亞硝胺類化合物測定主要集中在材質及釋放量的研究, 而針對遷移量的研究報道較少。由于遷移量的測定涉及酒精類食品模擬物, 存在的乙醇將導致N-亞硝胺提取困難, 本文采用GC-TEA法, 選擇10%乙醇、20%乙醇和50%乙醇3種食品模擬物為研究對象, 建立了食品接觸材料及制品中15種N-亞硝胺在酒精類食品模擬物中遷移量的測定方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-Ellutia 800 Series TEA（氣相色譜-熱能分析儀）, BUCHI Rotavapor R-300旋轉蒸發儀, Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）, EYELA MG-2200氮吹儀（日本東京理化器械株式會社）, 電子分析天平（精度0. 01 mg）。

12種N-亞硝胺混標：N-二甲基亞硝胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二正丙胺（NDPA）、N-亞硝基二異丁胺（NDiBA）、N-亞硝基二正丁胺（NDBA）、N-亞硝基哌啶（NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（NPYR）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亞硝基-N-甲基苯胺（NMPhA）、N-亞硝基-N, N-（三甲基己基）胺（NDiNA）、N-亞硝基二芐胺（NDBzA）（100μg/mL, 北京迪科馬科技有限公司）, N-亞硝基-N-甲基乙胺（NMEA）、N-亞硝基二異丙胺（NDiPA）（≥98%, 上海安譜實驗科技股份有限公司）；N-亞硝基二環己基胺（NDCHA, 100μg/mL, 曼哈格公司）；二氯甲烷、乙醇（色譜純, 上海安譜實驗科技股份有限公司）；其他試劑均為分析純；實驗用水為經Milli-Q凈化系統制備的去離子水。椰殼活性炭固相萃取小柱（上海安譜實驗科技股份有限公司）；多孔聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物固相萃取小柱、弱陽離子交換固相萃取小柱、親水親脂平衡固相萃取小柱（北京迪科馬科技有限公司）。

1.2 標準溶液的制備

準確稱取適量的15種N-亞硝胺化合物標準品（精確至0. 01 mg）, 用乙醇配制成質量濃度約為1 000 mg/L的標準儲備溶液, 逐級稀釋至0. 025、0. 05、0. 1、0. 2、0. 5 mg/L系列標準工作溶液, 臨用現配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 遷移試驗遷移試驗的條件選擇及操作步驟按照GB 4806. 11[5］、GB 31406. 1-2015[14］和GB 5009. 156-2016[15］的規定。遷移試驗容器選擇具塞錐形瓶, 試驗完成后, 手動用力搖動3～5次, 打開錐形瓶, 用鑷子取出樣品, 得到食品模擬物試液。若不能立即實驗, 需將食品模擬物試液于4℃冰箱中避光保存。

1.3.2 N-亞硝胺化合物遷移量試液的制備食品模擬物試液冷卻后, 移取40 mL試液于150 mL帶聚四氟乙烯塞的分液漏斗中, 加入1. 0 mL 5 mol/L的氫氧化鈉溶液, 再向分液漏斗中加入適量水和乙醇（共約60 mL）, 搖勻, 使分液漏斗內的試液中乙醇含量為20%（體積分數）。

1.3.3 提取與濃縮向“1. 3. 2”所得試液中加入二氯甲烷30 mL, 用手輕微逆時針搖晃分液漏斗, 蓋上漏斗蓋, 劇烈振蕩15 s, 必要時放氣。打開斗蓋, 靜置分層, 收集下層溶液, 用旋蒸瓶或K-D濃縮瓶收集, 重復提取2次, 合并提取液, 搖勻備用。

將提取液于25℃水浴溫度, 真空度25 000 Pa下旋轉、蒸發、濃縮至3～4 mL, 轉入玻璃氮吹管中, 室溫下用緩慢的氮氣吹至0. 8～0. 9 mL, 無水乙醇定容至1. 0 mL, 用0. 22μm針式尼龍過濾器上機待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 氣相色譜條件色譜柱：DB-FFAP色譜柱（30 m×0. 32 mm×0. 25μm）；進樣口溫度：170℃；程序升溫條件：初始溫度60℃, 保留2 min, 以15℃/min升至82℃, 以1℃/min升至88℃, 以15℃/min升至140℃, 保留7 min, 再以15℃/min升至240℃, 保留7 min；載氣：氮氣（純度≥99. 999%）；流速：1. 2 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：2μL。

1.4.2 熱能分析儀條件接口溫度：250℃；熱解室溫度：500℃；真空度：59. 8～66. 5 Pa；氧氣壓力：13 790 Pa；臭氧水平：244（22. 8 V）。

2 結果與討論

2.1 氣相色譜條件的優化

2.1.1 氣相色譜柱的確定考察了HP-5MS和極性柱（HP-INNOWax、DB-FFAP、Wonda Cap Wax色譜柱等）對目標化合物分離的影響。由于N-亞硝胺類物質均為極性化合物, 普通的HP-5MS弱極性柱分析時峰形易拖尾且重現性差。當采用HP-INNOWax柱時, 各目標化合物均能保持良好峰形, 但NEPhA與NMPhA無法實現基線分離；Wonda Cap Wax色譜柱會加速NEPhA與NMPhA降解成為乙基苯胺、甲基苯胺和一氧化氮, 導致熱能檢測器無法對這兩種物質進行測定；采用DB-FFAP色譜柱（30 m×0. 32 mm×0. 25μm）時, 15種N-亞硝胺化合物可實現良好的基線分離（見圖1）。

圖1 15種N-亞硝胺化合物的色譜圖（0. 25 mg/L）Fig. 1 Chromatogram of 15 N-nitrosamines（0. 25 mg/L）

2.1.2 進樣口溫度的確定實驗發現進樣口溫度會對NEPhA與NMPhA的降解產生較大影響, 其產物分別為乙基苯胺和甲基苯胺。對比了進樣口溫度分別為150、170、190、210℃時15種N-亞硝胺的色譜圖, 結果發現, 溫度對NDiNA、NDCHA、NDBzA、NEPhA、NMPhA具有顯著的影響, 其中NDiNA、NDCHA、NDBzA隨著溫度的升高, 響應值逐漸增大；NEPhA、NMPhA則隨著溫度的升高, 呈先上升后下降的趨勢, 且以170℃時的響應值最高, 同時也能保證NDiNA、NDCHA、NDBzA的響應值滿足檢測需要；當溫度升至210℃時, NEPhA、NMPhA已完全降解。最終將進樣口溫度設為170℃。

2.2 前處理條件的優化

N-亞硝胺類物質為路易斯堿, 將浸泡液調為堿性能有效降低N-亞硝胺類化合物在模擬液中的溶解度, 并增加其穩定性, 提升提取效率。綜合考慮N-亞硝胺類物質在不同溶劑中的溶解能力、溶劑與水溶液的相溶性、試劑的毒性等方面, 同時參考GB 28482-2012和EN 12868-2017的測定方法, 最后確認二氯甲烷作為提取溶劑, 既能保證提取效率, 又不會對實驗員和大氣環境造成太大污染。

由于陽性樣品不易獲得, 本文通過對空白實際樣品（天然橡膠片）的遷移試驗試液加標, 對前處理條件進行優化。浸泡方式為：每60 dm2食品接觸材料及制品接觸1 kg食品模擬物比例浸泡, 各種液態食品的密度以1 kg/L計。分別準確移取空白食品模擬物試液40 mL（10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇）于150 mL分液漏斗中, 加入1. 0 mL 5. 0 mol/L的氫氧化鈉溶液, 再加入0. 5 mL 1 mg/L的N-亞硝胺化合物混合標準溶液, 混合均勻, 使食品模擬物中N-亞硝胺的質量濃度為12. 5μg/L（相當于遷移量為12. 5μg/kg）。

2.2.1 萃取次數的優化分別以90 mL二氯甲烷提取1次、45 mL二氯甲烷提取2次、30 mL二氯甲烷提取3次, 考察了提取次數對15種N-亞硝胺類化合物回收率的影響。結果表明, 當提取次數為1次時, 3種模擬物的回收率普遍較低；當提取次數為2次時, 10%和20%乙醇的回收率提升至70%～80%；提取次數為3次時, 20%乙醇的回收率均大于90%；10%乙醇, 除NDMA回收率略低外, 其余化合物的回收率均與20%乙醇相近；50%乙醇的回收率為64. 8%～88. 0%。造成上述回收率差異的主要原因為：①N-亞硝胺易溶于乙醇, 而乙醇會阻礙二氯甲烷對目標物的提取。②隨著食品模擬物中乙醇含量的提高, 提取液中乙醇的含量增加。當提取液中乙醇含量過少時, 后期濃縮過程易受人為或儀器設備因素的影響, 造成提取液濃縮過度, 低沸點N-亞硝胺化合物（特別是NDMA）損失；當提取液中乙醇含量過多時, 會造成后期旋轉蒸發及氮吹濃縮的時間大幅增加, 也會導致低沸點N-亞硝胺的揮發, 回收率下降。為保證N-亞硝胺類化合物提取完全, 本文采用30 mL二氯甲烷提取3次, 并以20%乙醇食品模擬物為研究對象, 對前處理條件進行優化。

2.2.2 旋轉蒸發條件的優化在真空度為30 000 Pa下, 考察了不同水浴溫度（25、30、40、50、60℃）對15種N-亞硝胺類化合物回收率的影響, 結果表明：25℃時的整體回收率與30℃相近, 均大于90. 0%；水浴溫度對NDMA產生較大影響, 當水浴溫度大于40℃時, 水浴溫度越高, NDMA的回收率越低。由于二氯甲烷沸點為39. 8℃、易揮發, 溫度越高, 提取液越易爆沸, 進而污染儀器設備, 影響回收率。綜合考慮實驗耗時、安全性及回收率影響, 選擇水浴溫度為25℃。

在25℃水浴溫度下, 進一步考察了不同真空度（25 000、30 000、6 000 Pa）對15種N-亞硝胺類化合物回收率的影響, 結果表明：25 000 Pa和30 000 Pa的回收率無顯著差異, 回收率均大于90. 0%, 但25 000 Pa可以進一步縮短試驗時間；而用6 000 Pa直接減壓旋蒸至1 mL, 則時間延長, 且回收率降低（總體回收率為56. 0%～76. 8%）。綜合考慮回收率及時間, 本文選擇旋轉蒸發真空度為25 000 Pa。

2.2.3 振蕩時間的優化考察了不同振蕩時間（15、30、45、60、120 s）對15種N-亞硝胺類化合物回收率的影響。結果表明, 劇烈振蕩15 s時, 15種N-亞硝胺類化合物的回收率接近100%, 隨著振蕩時間延長, 回收率無明顯變化。綜合考慮操作時間和回收率, 本文將提取時間設為15 s。

2.2.4 氮吹條件的優化參照GB 28482-2012, 在室溫下調節氮氣流速, 確保濃縮表面形成的凹陷不超過2～3 mm（防止液體飛濺）, 考察了不同氮吹濃縮體積（近干、0. 4～0. 6 mL、0. 8～0. 9 mL）對回收率的影響（圖2）。結果表明：當氮吹至近干或0. 4～0. 6 mL時, 會造成低沸點N-亞硝胺類化合物的回收率降低, 特別是NDMA；氮吹至0. 8～0. 9 mL時, 15種N-亞硝胺類化合物的回收率為95. 2%～101%。因此, 本文將氮吹濃縮條件定為室溫氮吹至0. 8～0. 9 mL。

圖2 氮吹濃縮體積對回收率的影響Fig. 2 Influence of nitrogen blowing concentration volume on recovery

2.2.5 提取液中乙醇含量的優化由于50%乙醇食品模擬物的提取液中乙醇含量高, 導致濃縮時間長、回收率偏低, 因此需降低乙醇含量以確保N-亞硝胺回收率。通常降低提取液中乙醇含量的方法有直接蒸餾法、反滲透膜技術、稀釋法。

50%乙醇的沸點約82℃, 采用直接蒸餾法的蒸餾時間較長, 會導致低沸點的N-亞硝胺揮發, 造成損失；利用反滲透膜法需要大型的設備, 不適合日常檢測。由于前期已經對20%乙醇模擬物進行了研究, 發現具有濃縮時間適中、回收率高、重復性好等優點。因此, 本文用水將50%乙醇稀釋至20%乙醇后, 考察對N-亞硝胺回收率的影響。結果表明：經稀釋后50%乙醇提取液的濃縮時間縮短至原來的1/4, 且15種N-亞硝胺類化合物的回收率均大于90. 0%。

由于本文涉及多種食品模擬物, 為了確保方法統一, 本文將N-亞硝胺類化合物遷移量試液的制備確定為：食品模擬物試液冷卻后, 移取40 mL于150 mL帶聚四氟乙烯塞的分液漏斗中, 加入1. 0 mL 5 mol/L氫氧化鈉溶液, 再向分液漏斗中加入適量水和乙醇（合計約60 mL）, 搖勻, 使分液漏斗內試液中乙醇的體積分數為20%。

2.3 固相萃取法與液液萃取法的比較

目前, 固相萃取法常用于水樣中N-亞硝胺類化合物的測定, 但存在NDMA回收率偏低的缺點。本文考察了椰殼活性炭固相萃取小柱、多孔聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物固相萃取小柱、弱陽離子交換固相萃取小柱、親水親脂平衡固相萃取小柱對水及50%乙醇模擬物中15種N-亞硝胺類化合物回收率的影響。結果表明：上述4類固相萃取柱對水中的15種N-亞硝胺類化合物保留較好, 回收率為71. 2%～102%, 但對50%乙醇中的N-亞硝胺類化合物保留差, 回收率為4. 02%～93. 6%。造成上述結果的原因是：上述四種固相萃取柱主要通過反相作用力吸附化合物, 當上樣溶液乙醇含量增大時, 洗脫能力增強, 化合物保留能力降低, 造成回收率偏低。

通過比較, 上文優化的液液萃取法的回收率遠高于固相萃取法, 因此, 本文將液液萃取法確定為酒精類食品模擬物中N-亞硝胺類化合物的提取方法。

2.4 線性關系、檢出限與定量下限

對“1. 2”系列標準溶液進行分析, 以峰面積（y）為縱坐標, 對應的質量濃度（x, mg/L）為橫坐標繪制標準曲線。結果表明, 15種N-亞硝胺均在0. 025～0. 5 mg/L范圍內線性良好, 相關系數（r2）為0. 998 4～0. 999 9。本文以響應最低的物質為基準, 確定方法的檢出限（LOD, S/N≥3）為0. 200μg/kg, 定量下限（LOQ, S/N≥10）為0. 625μg/kg。方法的靈敏度滿足GB 4806. 11-修訂版中對N-亞硝胺遷移量的限量要求（SML=0. 01 mg/kg）。

2.5 準確度與精密度

選取天然橡膠片空白樣品, 添加不同濃度的混合標準溶液, 制成含量分別為0. 625、1. 25、6. 25 μg/kg的加標樣品, 每個樣品按前處理方法提取并平行測定6次, 計算得到15種N-亞硝胺類化合物的加標回收率及相對標準偏差（見表1）。結果表明, 15種N-亞硝胺類化合物的平均回收率為85. 7%～106%, 相對標準偏差（RSD）小于10%, 方法的準確度與精密度完全滿足分析要求。

表1 天然橡膠片中15種N-亞硝胺類化合物的平均加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations of 15 N-nitrosamines in natural rubber sheet（n=6）

2.6 實際樣品的檢測

選擇天然乳膠片、TRP湯勺、TPU片等共13份樣品, 按照“1. 3. 1”對實際樣品進行遷移實驗, 得到模擬物試液后, 按本方法進行檢測, 結果顯示樣品均為陰性。

3 結 論

本文采用液液萃取作為前處理方法, 結合氣相色譜-熱能分析儀同時測定食品接觸材料及制品中15種N-亞硝胺在酒精類食品模擬物中的遷移量, 解決了N-亞硝胺類化合物在酒精類食品模擬物提取難的技術難題, 并應用該方法對實際樣品進行測定。該方法操作簡便、定量準確、回收率高、靈敏度高、重現性好, 彌補了GB 4806. 11-修訂版檢測方法的空白, 滿足實際檢測需求。