基于Hedgehog信號通路探討血清NGF、BGLAP及PGS在顱腦損傷后加速骨折愈合的作用機制*

李 暉，李海冰，劉欣哲，張 華

(1.河北省邢臺市第三醫院骨科 054099；2.河北醫科大學第二醫院骨科，石家莊 050000)

早在1960年，臨床醫生就觀察到伴有顱腦損傷的肢體骨折患者骨折處骨痂形成更快、體積更大，且后續眾多基礎研究和臨床研究均證實顱腦損傷對肢體骨折愈合具有加速作用，這可能與顱腦損傷后血清和腦脊液中釋放的多種激素、細胞因子或相關神經因子對骨代謝的調節有關[1-3]。顱腦損傷可能會激活某些原本在胚胎時期調控骨發生的關鍵元件，誘導組織分化，促進骨形成。骨折愈合主要依靠骨形成作用，而骨形成是由多種因素調節的復雜而有序的過程。目前已經發現了多條與骨代謝密切相關的信號通路，但顱腦損傷后骨折愈合的具體機制尚不明確。Hedgehog信號通路不僅參與胚胎發育，還與成骨細胞的增殖和分化密切相關，近年來眾多研究表明其參與骨形成的調控作用[4-6]，但是目前研究多為體外研究和動物實驗，臨床研究鮮有報道。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是中樞神經系統中最具有代表性的神經營養因子，在大腦中分布廣泛和高度表達，在顱腦損傷后，NGF可被釋放至外周，可能參與顱腦損傷后骨折愈合[7]。前列腺素(prostaglandins，PGS)是花生四烯酸的環氧產物，可以由體內多種細胞通過自分泌和旁分泌方式釋放，其表達水平受中樞神經系統調控和機體應激反應影響，且參與骨代謝[8]。顱腦損傷會激活機體的應激反應，影響中樞神經相關調控，顱內神經營養因子外泄入外周血液循環系統，NGF和PGS可能參與顱腦損傷后骨折愈合。而骨鈣素(bone gla protein，BGLAP)是骨形成標志物，是反映骨折愈合的最直接標志物。本研究擬通過臨床研究，觀察顱腦損傷后骨折加速愈合過程中NGF、PGS、BGLAP及Hedgehog信號通路蛋白的表達，并探討之間是否存在聯系，以期為顱腦損傷后加速骨折愈合的機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2020年1月在河北省邢臺市第三醫院就診的138例因車禍導致的新鮮閉合性股骨干骨折患者為研究對象，其中男84例，女54例，年齡20～72歲，平均(32.66±5.35)歲。納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)新鮮閉合性股骨干骨折；(3)臨床資料完整；(4)研究組通過磁共振成像(MRI)確定為創傷性腦損傷；(5)與家屬談話，已獲得知情同意書。排除標準：(1)特重型顱腦損傷[格拉斯哥昏迷(GCS)評分<6分]；(2)合并神經系統疾病；(3)合并糖尿病；(4)合并自身免疫性疾病；(5)合并惡性腫瘤。根據是否合并顱腦損傷分為研究組(60例)和對照組(78例)。研究組為顱腦損傷合并股骨干骨折患者，男35例，女25例；年齡20～70歲，平均(33.47±6.68)歲；骨折分型A1 18例，A2 27例，A3 15例；顱腦損傷輕度19例，中度33例，重度8例。對照組為單純股骨干骨折患者，男49例，女29例；年齡22～72歲，平均(31.68±7.12)歲；骨折分型A1 25例，A2 44例，A3 19例。兩組性別、年齡、骨折分型等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，本研究已獲得河北省邢臺市第三醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1治療方法

研究組患者先行開顱血腫清除，然后根據具體情況進行額、顳極切除或去骨瓣減壓術，在顱腦情況穩定后轉入河北省邢臺市第三醫院骨科進行骨折治療。兩組患者均根據具體情況進行切開復位內固定手術或帶鎖髓內固定手術，術后進行常規康復訓練。

1.2.2觀察指標

術后4、8、12周進行X線片檢查，觀察骨折愈合情況并測量骨痂面積，骨痂面積=2π×(R2-r2)×L，其中R代表骨痂半徑，r代表股骨干半徑，L代表骨痂長度，記錄并比較兩組愈合時間。分別于術后1 d及術后1、4、8、12周抽取患者外周靜脈血5 mL于促凝管中，室溫放置30 min，3 500 r/min離心取上清液，采用ELISA檢測血清NGF、BGALP、PGS、印度豪豬蛋白(Indian hedgehog，Ihh)和鋅指轉錄因子1(Gli family zinc finger protein 1，Gli1)水平，試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，所有操作嚴格參照說明書進行。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 骨痂和愈合時間比較

研究組愈合時間為(11.69±1.47)周，對照組愈合時間為(14.02±1.83)周，兩組愈合時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組術后4、8、12周骨痂面積比較，研究組均大于對照組，經組間、時間點和組間·時間點交互效應比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組術后不同時間骨痂面積比較

2.2 Hedgehog通路相關蛋白比較

術后1 d至術后12周研究組Ihh、Gli1表達水平均高于對照組，組間、時間點和組間·時間點交互效應比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2、3。

表2 兩組術后不同時間血清Ihh水平比較

表3 兩組術后不同時間血清Gli1水平比較

2.3 NGF、PGS、BGLAP水平比較

術后1 d至術后12周研究組血清NGF、PGS、BGLAP水平均高于對照組，組間、時間點和組間·時間點交互效應比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4～6。

表4 兩組術后不同時間血清NGF水平比較

表5 兩組術后不同時間血清PGS水平比較

表6 兩組術后不同時間血清BGLAP水平比較

2.4 相關性分析

Pearson相關性分析表明，血清NGF、BGLAP、PGS水平與骨痂面積均呈正相關(P<0.05)；血清Ihh、Gli1水平與血清NGF、BGLAP、PGS水平及骨痂面積也均呈正相關(P<0.05)，見表7。

表7 血清NGF、PGS、BGLAP水平與骨痂面積、Ihh、Gli1水平的相關性分析(n=138)

3 討 論

目前，臨床仍有不少比例的復雜骨折或粉碎性骨折患者因高能量創傷、感染或治療不當等多種原因導致長骨骨缺損、骨不連或骨不愈合，對于這類患者臨床尚無特效治療方法，主要以手術治療為主。但手術治療不僅給患者帶來巨大的痛苦和經濟負擔，而且常常仍難以達到理想效果，這仍然是臨床骨科的難題之一。顱腦損傷與骨折愈合之間的聯系被報道已久，臨床已經證實顱腦損傷患者的長骨骨折表現出更快的愈合速度，這為難愈性骨折和骨缺損的治療帶來了新思路。許多動物實驗也發現，顱腦損傷后肢體骨折出現異常增生可能與其體內的顱腦損傷后多條通路途徑激活和相關因子調節有關[9]，已有體外實驗和動物實驗聚焦于探究顱腦損傷后骨折加速愈合的機制，但目前尚不完全清楚。Hedgehog信號通路是近年來新提出的骨折愈合通路，本研究擬通過臨床研究探討Hedgehog信號通路是否與顱腦損傷后骨折加速愈合相關，并分析相關促愈合因子的相關性。

Hedgehog信號通路參與包括骨代謝和骨形成在內的人體多種代謝調控。Hedgehog基因于1980年在果蠅中被發現，因該基因突變會導致果蠅呈刺猬狀而被命名，包括音速豪豬蛋白(sonic hedgehog，Shh)、沙漠豪豬蛋白(desert hedgehog，Dhh)和Ihh 3種亞型。在人體中，這3種蛋白分別在發育的不同時期被分泌，Shh主要在胚胎時期參與中樞神經系統發育，Dhh主要負責調控外周神經系統發育，Ihh主要負責骨代謝。Ihh通過與其特異性受體跨膜蛋白受體(patched，PTC)結合來激活G-蛋白偶聯受體(GPCR)，進一步發生級聯放大反應，激活下游轉錄因子鋅指蛋白(Gli)的轉錄，發揮促進軟骨細胞和成骨細胞分化的功能[10-11]。本研究中術后4周開始，研究組骨痂面積明顯大于對照組，這種差距隨著時間的推移愈加明顯，且研究組愈合時間較對照組明顯縮短，說明顱腦損傷會加速股骨干骨折愈合。同時跟蹤Ihh和Gli1兩種蛋白，發現研究組術后蛋白水平均明顯高于對照組，且研究組在術后4周Ihh和Gli1均已經達到峰值并一直保持在較高水平，而對照組在術后8周Ihh才到達峰值，且Ihh和Gli1一直保持在較低水平。這提示顱腦損傷后Hedgehog信號通路呈現高表達狀態，這可能是其加速骨折愈合的原因。

顱腦損傷后腦脊液泄露到外周循環，目前普遍認為外泄的腦源性因子具有骨誘導性，可能參與骨形成作用。NGF是大腦中代表性的神經營養因子，在兔創傷性腦損傷合并脛骨骨折模型中被發現能刺激骨形成[12]，在骨折大鼠中同樣發現注射外源性NGF能加速骨折愈合[13]，體外細胞實驗發現NGF培養能刺激成骨細胞分化[14]。王斌等[15]在大鼠骨折模型中采用NGF聯合血小板衍生因子進行治療，發現NGF能通過促進血管內皮生長因子(VEGF)表達來促進血管生成從而達到促進骨折愈合的作用。本研究中研究組血清NGF水平均明顯高于對照組，同時檢測骨形成標志物BGLAP發現，研究組血清BGLAP水平也明顯高于對照組，且其變化趨勢與NGF一致，這表明研究組骨形成速度高于對照組，提示顱腦損傷導致的NGF水平提高可能是促進骨折愈合的關鍵。這可能是因為顱腦損傷后NGF可以透過血腦屏障進入血液循環到達骨折處，促進成骨細胞分化，加速骨形成作用。

除了NGF，PGS近年來也被發現能加速骨形成和骨改建。研究發現，顱腦損傷后血清花生四烯酸水平明顯提高，花生四烯酸是PGS的前體，可通過生成PGS來上調BGLAP表達來，促進骨細胞增殖，加速骨礦化，被認為是腦損傷和骨折愈合之間的橋梁[16]。PGS具有刺激骨形成作用，細胞實驗表明其能促進成骨細胞增殖[17]；體內試驗也表明PGS能增加骨基質形成，提高骨組織鈣化，促進成骨細胞的增殖和分化，提高骨愈合速度[18]。本研究中，研究組術后血清PGS水平明顯高于對照組，這可能是由于顱腦損傷后機體中樞神經上調PGS表達，也可能是顱腦損傷引起的應激反應導致PGS升高。雖然其具體機制尚不清楚，但作者發現PGS的變化趨勢與Ihh、Gli1、NGF和BGLAP基本一致，研究組不僅表現出更高的表達水平，并在更早的時間達到峰值，提示這可能與其促進骨愈合相關。本研究進一步進行了相關性分析，發現血清NGF、BGLAP、PGS水平與骨痂面積呈正相關(P<0.05)，血清Ihh、Gli1水平與血清NGF、BGLAP、PGS水平及骨痂面積也呈正相關(P<0.05)。

綜上所述，本研究經過臨床研究發現顱腦損傷后兩種促進骨形成的因子NGF和PGS，骨形成標志物BGLAP，Hedgehog通路相關蛋白Ihh和Gli1表達水平均升高，且其相互之間均存在正相關關系，提示Hedgehog通路上調可能會通過級聯放大影響下游NGF和PGS水平，進一步促進骨形成，加速骨愈合，但其具體的調控機制還需要進一步研究。