去氫松香酸在大鼠體內的絕對生物利用度

韓 君

(北京康仁堂藥業有限公司，北京 101301)

去氫松香酸(dehydroabietic acid)與松香酸都是松香的主要成分，來源于松柏、云杉、落葉松和冷杉等針葉類植物[1]。去氫松香酸具有抗炎等生物活性，如：通過PPAR-γ和PPAR-α的雙重激活減輕高脂肪飲食誘導的胰島素抵抗和肝臟脂肪變性[2]；通過激活Keap1/Nrf2-ARE信號通路來減少非酒精性脂肪肝的鐵死亡[3，4]。文獻鮮有對其在大鼠體內的絕對生物利用度的相關研究。目前，高效液相色譜-質譜聯用法因其特異性強、靈敏度高，在血藥濃度定量分析領域應用廣泛[5-7]。本實驗采用液相色譜-質譜聯用方法建立測定大鼠血漿中去氫松香酸的方法并運用于大鼠體內藥代動力學研究，為后續該化合物的相關研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和儀器

去氫松香酸(批號：X28M7B14793，上海源葉生物科技有限公司)；SOLUTOL HS 15(批號：O21GY164716，上海源葉生物科技有限公司)；去氫松香酸標準品(批號：PCS-210816，成都植標化純生物技術有限公司)；格列本脲(Sigma-Aldrich公司，美國)。液質聯用儀(島津LCMS8030)。

8只SD雄性大鼠購自杭州醫學院，許可證號為SCXK(浙)2019-0002。動物飼養環境屏障設施：實驗室設施許可證編號SCXK(浙)2018-0016；飼養溫度保持在20～26 ℃，確保溫度變化不超過4 ℃；濕度控制在40%～70%，避免噪聲刺激，將動物房內的噪聲控制在60 dB或以下。本實驗使用的大鼠和喂養條件符合《實驗動物管理辦法》的規定。

1.2 色譜和質譜條件

色譜柱為ODSC18柱(100×2.1 mm,3.5 μm)，柱溫為40 ℃，流動相(A，CAN；B，0.1%FA水溶液)。流動相梯度：0～0.5 min，60%～5% A；0.5～1 min，5% A；1～2 min，5%～60% A；2～7 min，60% A。流速為0.25 mL/min，進樣量10 μL。每個樣品檢測所需時間為7 min。質譜為電噴霧離子源(ESI)，多級反應檢測(MRM)，負離子模式。

1.3 溶液制備

分別精密稱取去氫松香酸10 mg，加入甲醇定容至10 mL，配制成質量濃度為1 mg·mL-1的儲備液。取去氫松香酸儲備液，用甲醇進行梯度稀釋，配制成50、100、200、500、800、1 000、5 000和10 000 ng·mL-1的工作液。取格列本脲儲備液，用乙腈稀釋為質量濃度為200 ng·mL-1的內標工作液。采用去氫松香酸標準品配制濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的去氫松香酸標準溶液。

1.4 血漿樣本處理

取50 μL血漿，加入150 μL內標工作液，渦旋振蕩3 min，14 000 r·min-1離心20 min，取120 μL上清液進行質譜檢測分析。

1.5 專屬性

按照色譜條件，測定空白大鼠血漿、含內標和去氫松香酸的標準血漿樣本、只含內標的空白樣本、灌胃去氫松香酸7 min的血漿樣品、尾靜脈注射去氫松香酸7 min的血漿樣品的離子流色譜圖。

1.6 線性關系

取空白血漿45 μL，分別加入5 μL去氫松香酸標準溶液，配制成相當于去氫松香酸濃度為50、100、200、500、800、1 000、5 000、10 000 ng·mL-1的基質樣本，按1.4方法操作。每個濃度平行處理2份(n=2)，并以權重因子1/X2進行線性回歸。

1.7 精密度與回收率試驗

取50 μL空白血漿，加入去氫松香酸標準溶液，配制成去氫松香酸濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的質控樣本(n=6)。并按1.4方法處理后進樣分析，連續測定3次，分析結果通過標準曲線擬合計算，用偏差表示準確度，用變異系數表示精密度。

分別取空白血漿以及空白血漿加入乙腈提取后的溶液各50 μL，加入去氫松香酸標準溶液，配制成去氫松香酸濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的質控樣本(n=6)。通過比較常規質控樣品與加入分析物及內標溶液的提取空白樣品中分析物及內標的響應值，來計算回收率(用百分比表示)。

1.8 基質效應

取50 μL空白血漿(基質)和超純水50 μL，分別加入去氫松香酸標準溶液，配制成相當于去氫松香酸濃度為150和750 ng/mL的質控樣本(n=6)。用基質存在時的峰面積(A1)與基質不存在時的峰面積(A2)的比值表示分析物和內標的基質因子(MF)，MF=A1/A2。用分析物的基質因子除以內標的基質因子，計算經內標歸一化的基質因子。

1.9 穩定性考察

取50 μL空白血漿，加入格列本脲標準溶液，加入去氫松香酸標準溶液，配制成相當于去氫松香酸濃度為150、750和7 500 ng·mL-1的質控樣本(n=6)。分別考察空白血漿室溫放置24 h、-80 ℃反復凍融3次，提取后樣本室溫放置24 h、-80 ℃放置72 h，以及配制的150、750和7 500 ng·mL-1濃度的質控樣本室溫放置24 h的穩定性。穩定性樣本和新鮮配制的樣本均按1.4方法處理后進行進樣分析。

1.10 藥代動力學試驗

8只SD大鼠實驗前禁食12 h后隨機均分為口服給藥組和靜脈注射組兩組。口服給藥組通過灌胃給藥10 mg·kg-1去氫松香酸，靜脈注射組通過尾靜脈給藥1 mg·kg-1去氫松香酸。口服給藥組樣品制備方法為稱量去氫松香酸適量，加入0.5%羧甲基纖維素鈉，超聲混懸，配制成相應的混懸液。靜脈注射組樣品制備方法為稱量去氫松香酸適量，加入10%二甲基亞砜、20% SOLUTOL HS 15和70%生理鹽水。采血點設計如下：口服給藥前及服藥后0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h時，眼眶后靜脈叢采血300～400 μL，血液轉移至預先加入EDTA-K2的1.5 mL試管中；靜脈注射前及注射后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h時，眼眶采血300～400 μL，血液轉移至預先加入EDTA-K2的1.5 mL試管中。全血樣品離心10 min(8 000 r·min-1, 4 ℃)，獲取血漿100～200 μL，血漿樣品立即放入-70 ℃冰箱中凍存。整個樣品處理過程在采血后15 min 內完成。

2 結果

2.1 專屬性

去氫松香酸保留時間為4.3 min，內標保留時間為3.6 min，空白血漿中內源性物質不干擾藥物和內標的測定，內標物不干擾藥物的測定，見圖1。

圖1 專屬性試驗色譜圖：空白大鼠血漿(A)、含內標和去氫松香酸的標準血漿樣本(B)、只含內標的空白樣本(C)、灌胃去氫松香酸7 min的血漿樣品(D)、尾靜脈注射去氫松香酸7 min的血漿樣品(E)

2.2 標準曲線與定量下限

去氫松香酸回歸方程y=6.250 9x+1 230.2，線性范圍為50～10 000 ng·mL-1，R2=0.999 6，最低定量下限為30 ng·mL-1。

2.3 精密度與回收率

批內和批間精密度誤差均未超過20%，方法總誤差(即相對偏差絕對值與變異系數之和)未超過30%，回收率可達90%以上，回收率和相對回收率的變異系數小于15%。

2.4 基質效應

由6批基質計算的內標歸一化的基質因子的變異系數均小于15%。

2.5 穩定性

經處理的血漿在室溫放置24 h、-80 ℃反復凍融3次、提取后樣本室溫放置24 h、-80 ℃放置 72 h，以及配置的150、750和7 500 ng·mL-1濃度的質控樣本室溫放置24 h仍能保持穩定，每份溶液的儀器響應值變異系數在10%之內，并且兩份溶液儀器平均響應值的差異在±10%之內。

2.6 藥代動力學研究結果

采用建立并經過驗證的方法檢測大鼠血漿中去氫松香酸的濃度，繪制血藥濃度-時間曲線見圖2，使用WinNolin 6.1軟件分析藥代動力學參數見表1。由圖2(A)可知，大鼠口服去氫松香酸后，血液中藥物濃度逐漸上升，18 min達到最大吸收，即達峰時間Tmax為(0.3±0.0)h，達峰濃度Cmax為(4 996.4±958.1)ng·mL-1。由圖2(B)可知，去氫松香酸注射進入大鼠體循環后，6 min血液中藥物濃度即達最高點，即Tmax為(0.1±0.0)h，Cmax為(5 928.0±803.2)ng·mL-1，并且血藥濃度隨時間推移逐漸降低。由表1可知，大鼠口服和靜脈注射去氫松香酸的絕對生物利用度(Fabs)為16.5%。

圖2 大鼠去氫松香酸給藥后血藥濃度-時間曲線：口服10 mg·kg-1(A)、靜脈注射1 mg·kg-1(B)

表1 大鼠靜脈注射和口服去氫松香酸的藥代動力學參數

3 結語

劑量確定實驗中，口服灌胃給藥3個劑量，10 mg·kg-1、100 mg·kg-1和500 mg·kg-1，每個劑量3只大鼠，連續觀察大鼠生存狀態和死亡情況，在14 d的觀察期內，沒有大鼠死亡，大鼠的體重也沒有明顯差異。本研究建立的方法靈敏準確，選擇性好，方法驗證都符合生物樣品分析方法的基本要求，適用于大鼠血漿去氫松香酸的藥代動力學研究。