乳酸菌降解發酵蔬菜中亞硝酸鹽的研究現狀

龔福明，何彩梅，吳桂容，郭繼毅

(1.賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899；2.德宏職業學院 基礎醫學院，云南 芒市 678400)

發酵蔬菜歷史悠久，是一類以新鮮蔬菜為原料，加入一定量食鹽后，在原料本身附著的有益微生物的作用下，通過控制其益生性微生物生長條件對蔬菜進行加工而成的風味獨特，具有抗衰老、減脂、抗氧化、甚至抗COVID-19等功效的發酵蔬菜產品。不同的發酵原料及發酵工藝可得到泡菜、酸菜、醬菜等多種形式的發酵蔬菜產品，現階段的代表性產品包括四川泡菜、涪陵榨菜、東北酸菜、貴州辣椒醬以及以甘肅蘭州和陜西陜南的漿水菜為代表的傳統腌制蔬菜；營養豐富、保健功效良好、酸鮮可口、開胃下飯等特性使傳統腌制的發酵蔬菜逐漸成為人們不可或缺的日常小菜，并逐漸形成一定的產業規模。然而在粗放的傳統發酵工藝條件下，蔬菜中富積的硝酸鹽在長期發酵腌制過程中容易被硝酸還原菌等微生物還原為亞硝酸鹽并大量積聚，導致發酵蔬菜中亞硝酸鹽超標，影響發酵蔬菜品質與食用。相關報道表明，過量攝入含亞硝酸鹽的食物會導致中毒性高鐵血紅蛋白癥，甚至死亡；同時亞硝酸鹽還能與蛋白質分解產物胺類反應生成具有極強致畸、致癌特性的亞硝胺等N-亞硝基化合物引發癌癥及胎兒畸形。因而篩選高效降解亞硝酸鹽的優良菌株，設法降低亞硝酸鹽及其前體化合物硝酸鹽的攝入成為提高發酵蔬菜品質、實現發酵蔬菜產業規模化與標準化發展亟需解決的核心技術。

乳酸菌是國際公認的食品安全級(generally recognized as safe, GRAS)微生物，被廣泛運用于食品加工等產業。相關報道表明，蔬菜中分布著大量的乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌及少量的其他菌群，其中乳酸菌是蔬菜發酵的主要作用微生物，在發酵過程中除具有降低發酵液pH值，發揮抑制有害菌生長的防腐作用及加強營養，賦予產品芳香的風味、良好口感與優良保健功效外，還具備顯著降低發酵蔬菜產品中亞硝酸鹽含量的活性。隨著人們認識的深入及健康生活理念的興起，發酵蔬菜日益受到消費者的關注，通過乳酸菌作用有效降低發酵蔬菜中亞硝酸鹽含量，提升產品質量與口感成為制備綠色發酵蔬菜的關鍵。本文將對蔬菜發酵過程中降解亞硝酸鹽的主要作用乳酸菌及其亞硝酸鹽降解機制與影響因素等進行綜述，為乳酸菌發酵制備綠色低亞硝酸鹽發酵蔬菜提供了理論依據與參考。

1 發酵蔬菜中降解亞硝酸鹽的乳酸菌

發酵蔬菜是歷史悠久的世界性發酵食品，傳統的固態高鹽發酵會因蔬菜發酵過程中產生大量亞硝酸鹽而影響發酵蔬菜的品質與安全性。相關研究報道表明，微生物降解亞硝酸鹽是生物降解亞硝酸鹽的主要方式，而蔬菜發酵過程中分屬于乳桿菌屬()、明串珠菌屬()、腸桿菌屬()、乳球菌屬()、腸球菌屬()、片球菌屬()及魏斯氏菌屬()7個屬20余個種的乳酸菌，因其普遍具有降解亞硝酸鹽、安全且高效的特性而成為發酵蔬菜生產過程中降解亞硝酸鹽的優勢候選微生物。張興吉等分離得到的275株乳酸菌均具有降解亞硝酸鹽的能力，半數以上乳酸菌菌株的亞硝酸鹽降解率>90%，優勢菌中發酵乳桿菌()的降解率最差且不穩定，降解率最低，僅為4.8%；植物乳桿菌()的降解率最強且穩定，其亞硝酸鹽降解率>96.7%，最高可達99.6%；其中植物乳桿菌()與短乳桿菌()是當前降解亞硝酸鹽能力極強且報道比較多的乳酸菌菌種。

蔬菜發酵乳酸菌菌種及發酵工藝的差異導致不同菌種甚至是同一菌種不同菌株之間在降解亞硝酸鹽能力方面存在顯著差異。相關研究報道證實，乳酸菌除具有防腐，加強營養，賦予產品芳香風味及良好口感與優良的保健功效外，還具備降低亞硝酸鹽等有害代謝產物，提升品質與安全的特性，其發酵制備的泡菜等發酵蔬菜產品也更符合大眾消費口味。張雪梅等在蘿卜發酵過程中證實，人工接種乳酸菌發酵的蘿卜泡菜中亞硝酸鹽含量明顯低于自然發酵泡菜，3種乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的排序為短乳桿菌>腸膜乳桿菌>植物乳桿菌；且多菌種混合發酵降解亞硝酸鹽的能力強于單菌種發酵，當腸膜明串珠菌和短乳桿菌混合發酵，且比例為1∶3時，蘿卜泡菜的發酵效果最佳，降解亞硝酸鹽的能力也最強。

2 乳酸菌降解發酵蔬菜中亞硝酸鹽的機理

乳酸菌是蔬菜發酵過程中的主要作用菌群，同時也具備極強的亞硝酸鹽降解能力，菌株自身直接降解亞硝酸鹽的途徑主要是酶解途徑和酸降解途徑，蔬菜發酵過程中兩種機制共同發揮作用，但在作用時間上存在差異。遲乃玉等研究發現，萊氏乳桿菌()、植物乳桿菌()、乳脂鏈球菌()等多種乳酸菌降解亞硝酸鹽的活性會隨發酵產酸后溶液pH值變化而被分為兩個階段：當發酵培養液pH>4.5時即發酵前期以酶降解為主；當發酵培養液pH<4.0時即發酵后期以酸降解為主。微生物酶解亞硝酸鹽的途徑有反硝化路徑和銨形成途徑(硝酸鹽異化還原成銨,DNRA)，Liu等在干酪乳桿菌鼠李糖亞種(subsp.)6013(LCR 6013)亞硝酸鹽降解的研究中證實，LCR 6013等乳酸菌能通過反硝化路徑實現亞硝酸鹽的酶解，而不是銨形成途徑。在酶解途徑中反硝化路徑的關鍵酶是亞硝酸鹽還原酶，在該酶及一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶的作用下對NO→NO→NO進行依次降解，最終將亞硝酸鹽轉為氮氣以完成酶解過程。酸降解途徑是乳酸菌代謝過程中產生乳酸等有機酸釋放的H能與發酵液中NO結合生成亞硝酸，進而發生非酶歧化反應最終將亞硝酸鹽降解生成NO，進而有效降低發酵蔬菜中亞硝酸鹽含量。相關研究證實，類似5-7-3等菌株的非酶歧化化學反應降低亞硝酸鹽的能力與環境酸度成正比關系，與pH值成反比，即總酸度越高(pH越低)，菌株降低亞硝酸鹽的非酶歧化反應能力越強，反之越弱。

另外，發酵蔬菜中的乳酸菌還存在降解亞硝酸鹽的間接途徑，即通過其代謝產物的抑菌作用發揮降解亞硝酸鹽的功效。有研究報道證實，乳酸及細菌素等乳酸菌代謝產物能通過抑制大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、熒光假單胞菌、產堿假單胞菌等硝酸還原菌生長的機制降低發酵蔬菜中亞硝酸鹽的生成與積累。此外，發酵過程中產生的V等微生物代謝產物也在一定程度上存在降低亞硝酸鹽產生和積累的作用，具體機制還有待于深入研究。

3 乳酸菌降解發酵蔬菜中亞硝酸鹽的影響因素

乳酸菌是蔬菜發酵過程中的主要作用微生物，其自身蛋白分解能力弱，氨基酸、維生素等營養物質合成能力弱，代謝產物的自身抑制作用及營養要求較高，生長易受溫度、pH值及滲透壓的影響，以及亞硝酸鹽還原酶在催化反應時需要適宜溫度、pH值、一定金屬離子等條件，使發酵蔬菜原料、發酵pH值、發酵溫度、NaCl添加量與發酵乳酸菌菌種及接種量等外界因素與條件成為影響乳酸菌發酵降解發酵蔬菜中亞硝酸鹽的關鍵。

3.1 發酵原料

可用于制備發酵蔬菜的原料繁多，常見的有芥菜、黃瓜、甘藍、辣椒、蘿卜、大白菜、雪菜、豇豆、豆角等原料，并可制備成泡菜、酸菜、醬菜三大類發酵蔬菜制品。一般來說，各類蔬菜的硝酸鹽平均積累量排序為根菜類>葉菜類>莖菜類>果菜類>花菜類，而硝酸鹽積累量越高，蔬菜在發酵過程中也越容易累積亞硝酸鹽。閆亞梅等以大白菜為主料，加入豇豆、白蘿卜、胡蘿卜與黃瓜等蔬菜進行組合發酵，發現“亞硝峰”峰值僅為13 mg/kg，比單一發酵時低得多，說明原料也是影響泡菜發酵的關鍵因素。另外，發酵蔬菜自身原料決定了發酵工藝的差異，導致原料處理、添加姜、糖、蒜、蔥、辣椒、八角等香辛料及NaCl與有機酸等成分和含量也存在差異，而熱漂燙和低溫貯藏及類似于姜等香辛料含有的生姜精油、姜辣素等活性物質及高濃度鹽和酸在一定程度上能通過物理作用、抗氧化、抑制硝酸鹽還原菌生長等特性降低或減少發酵蔬菜中亞硝酸鹽的積累。

3.2 發酵條件

3.2.1 pH值

乳酸菌及其產生的亞硝酸鹽還原酶在作用時對pH值都有一定要求，乳酸菌生長發酵最適pH值介于5.5～6.5之間，亞硝酸鹽還原酶最適pH值為5.0。同時亞硝酸鹽在酸性條件下極不穩定，可發生一定程度的自然降解，加速亞硝酸鹽的降解進而降低其含量。有報道表明，乳酸菌降解亞硝酸鹽的酶解和酸降解機制共同作用，pH值是乳酸菌降解亞硝酸鹽的主要決定因素且與亞硝酸鹽降解率成反比關系。另外，發酵環境pH值高于或低于細胞正常pH值(5.5～6.5)時，亞硝酸鹽還原酶活性降低，亞硝酸鹽還原速率也隨之迅速下降；發酵后期乳酸等酸性物質大量積累導致pH值降低，當pH值<4.0時亞硝酸鹽還原酶降解作用不明顯，乳酸菌主要以酸降解途徑來降解亞硝酸鹽。遲雪梅等在三段式(即發酵初期為自然發酵,發酵中期接種高產亞硝酸還原酶的乳酸菌,發酵后期接種產酸的乳酸菌)發酵甘藍的研究中證實pH值確實是影響乳酸菌降解亞硝酸鹽的主要因素，其發酵過程中接種乳酸菌的差異導致pH值變化能決定發酵甘藍中乳酸菌降解亞硝酸鹽的方式并能有效將發酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量降至最低。

3.2.2 溫度

乳酸菌生長的溫度介于30～40 ℃之間，所產生的亞硝酸鹽還原酶的作用溫度也介于30～40 ℃之間，一旦超過此范圍，溫度過高或過低均會影響乳酸菌生長及其所產生亞硝酸還原酶的活性與乳酸等有機酸和細菌素等活性物質的含量，最終使乳酸菌降解亞硝酸鹽的途徑受到影響或阻斷。隋明等在甘藍泡菜發酵制備中發現，30 ℃是最有利于泡菜制備和添加乳酸菌制劑發酵的溫度，此溫度條件下發酵基質的pH值最低，降解亞硝酸鹽的能力最強，亞硝酸鹽殘留量最低，泡菜感官評分最高。另外，發酵乳酸菌菌株不同會導致最適溫度有所差異，蘇肖晶用戊糖乳桿菌 B1、植物乳桿菌 C1和植物乳桿菌D等23種乳酸菌進行組合發酵研究發現，最適發酵溫度為35 ℃，在相應生長及作用溫度范圍內發酵體系溫度越高，亞硝酸鹽降解率越高。與此同時，有報道表明提高溫度能縮短乳酸菌發酵蔬菜的周期，使“亞硝峰”較早出現，同時最終的“亞硝峰”峰值也會最低且一直低于其他溫度值。然而溫度過高會導致丁酸梭菌()等雜菌生長，因而結合泡菜多采用常溫發酵的實際，篩選嗜冷且安全性高的乳酸菌作為發酵起子成為發酵蔬菜產品未來的發展趨勢。Kim等在韓國泡菜(kimchi)的溫控實驗中發現，-1 ℃條件下發酵7 d，清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和短乳桿菌的亞硝鹽降解率依次為87.9%、66.0%、57.1%，但溫度提高到15 ℃時，3種乳酸菌的亞硝酸鹽降解率幾乎為100%。

3.2.3 NaCl濃度

NaCl是蔬菜發酵過程中不可或缺的添加劑，一方面有著調節泡菜風味、防腐抑菌的作用，另一方面也可作為乳酸菌等發酵作用微生物生長繁殖的營養條件，并通過鹽濃度讓蔬菜中可溶性營養成分進入發酵液，供發酵微生物吸收利用。相關報道表明，發酵蔬菜由來的乳酸菌都具有一定耐鹽性，能在NaCl含量1%～10%的發酵蔬菜中生長并表現出降解亞硝酸鹽的特性。因耐鹽性，低濃度NaCl對乳酸菌生長及其亞硝酸鹽降解能力影響不大甚至有促進作用，但不能完全抑制腐敗菌生長；隨著NaCl濃度增加至一定值后，乳酸菌等發酵微生物的生長受到抑制，進而影響了乳酸菌的亞硝酸鹽降解能力。熊濤等在NaCl添加量對自然發酵圓白菜影響的研究中證實，不同NaCl含量對泡菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力有明顯影響，低濃度(NaCl濃度為2%)時乳酸菌繁殖最快，產酸最多，pH值最低；食鹽濃度為2%時有害微生物得到有效抑制，快速降解了泡菜中的亞硝酸鹽，僅發酵0.5 d后就快速出現了“亞硝峰”，高濃度(NaCl濃度為8%)時泡菜中乳酸菌生長受到了抑制，泡菜成熟期也相應的延長。

3.2.4 乳酸菌接種量

傳統泡菜發酵中以乳桿菌屬()、明串珠菌屬()、片球菌屬()等乳酸菌為主要發酵菌群的階段是決定泡菜風味、品質及其亞硝酸鹽等代謝產物分解轉化的關鍵。因此，改善風味與口感，降低亞硝酸鹽含量，提升品質，篩選發酵速度快、風味優且亞硝酸鹽降解能力強的功能性乳酸菌進行純種發酵或混合發酵成為現代泡菜產業的發展趨勢。報道表明，接種乳酸菌降解亞硝酸鹽有一個最適接種量，低于最適接種量之前，乳酸菌接種量與亞硝酸鹽降解量成正比，大于最適接種量后則成反比，因此接種量過多或過少均不利于泡菜發酵及代謝產物亞硝酸鹽等物質的降解與轉化。趙慧娟等在乳桿菌Lyoflora V3接種量對亞硝酸鹽降解的研究中證實菌株Lyoflora V3的最佳接種量為5%，低于或高于此接種量，乳桿菌Lyoflora V3的亞硝酸鹽降解效果均較差。隨著研究深入，混合發酵逐漸成為泡菜等發酵蔬菜產業的發展趨勢，姜雪晶等在副干酪乳桿菌()、布氏乳桿菌()和凝結芽孢桿菌()3種乳酸菌混合發酵酸菜的研究中發現，混合菌群發酵酸菜的亞硝酸鹽濃度(1.593 mg/kg)明顯低于自然發酵酸菜(3.641 mg/kg)，且其感官品質、風味及氨基酸、Vc與有機酸L-乳酸等營養物質及風味物質含量均優于自然發酵酸菜。

3.3 其他影響因素

乳酸菌降解亞硝酸鹽的特性與乳酸菌及其產生的亞硝酸鹽還原酶直接相關，而降解亞硝酸鹽特性除受上述發酵原料與主要發酵條件影響外，還受到接種乳酸菌種類、抗氧化物質(黃酮類、維生素A、維生素C、維生素E)、益生元、亞硒酸鈉等添加劑及酶激活劑(EDTA 與金屬離子Zn、K、Fe、Fe、Cu)等因素的影響，具體作用機理還有待深入研究。

4 結論

綜上所述，當發酵條件適合時，發酵蔬菜中的主要作用微生物乳酸菌確實能通過酶解途徑與酸解途徑及代謝產物抑制硝酸還原菌與腐敗菌生長等直接與間接機制降解發酵蔬菜中的亞硝酸鹽；加之乳酸菌能增強發酵蔬菜的營養，改善其風味與口感，提升相應產品質量與安全的特性，乳酸菌是良好的蔬菜發酵起子。但乳酸菌降低發酵蔬菜中亞硝酸鹽，改善品質，提升口感的研究大多處于實驗室研究階段，對其安全性評價與控制體系及運用工業化、標準化發酵蔬菜實現規模化生產的研究還有一定差距。但隨著人們認識的深入及健康生活理念的興起，憑借降解亞硝酸鹽分子機理與基因組學研究及乳酸菌與發酵食品體系相互作用機制的闡明，乳酸菌發酵蔬菜產品將成為備受人們關注與喜愛的綠色發酵產品。