新疆190份棉花材料的遺傳多樣性評價

權永剛，姜輝，武曉剛，楊恒超，藺懷龍，常寶學，郭建強，陳愛民

(1.九圣禾種業股份有限公司，新疆 昌吉 831100；2.農業農村部西北內陸棉花品種創制重點實驗室，新疆 昌吉 831100)

棉花是我國重要的經濟作物和紡織工業原料，在國民經濟中具有不可替代的地位。根據棉花種植區域的生態條件以及生產的特點，我國棉花生產主要集中在黃河流域、長江流域和西北內陸三大棉區。近年來，隨著國內外經濟形勢的變化和國家產業政策的調整，我國棉花生產區域化，種植面積在長江流域和黃河流域大幅下滑，機械化水平較高的新疆成為我國主產棉區，也是我國唯一的長絨棉產區，其棉花種植面積和產量達到全國的80%以上。隨著棉花產業形勢的發展，中國培育和審定棉花新品種的速度快且數量多，而棉花長期遺傳定向改良，骨干親本數量有限且反復集中利用，導致新疆棉花品種的遺傳基礎較為單一，遺傳差異越來越小，完全依據傳統生物學形態特征進行棉花品種的辨別和分類越來越困難。同時，推向大田生產的速度也在加快，導致新疆種子市場“混、雜、亂”現象突出，嚴重阻礙了棉花產業的健康持續發展。

分子標記因不受環境影響且可以從 DNA分子層面上反映出生物個體間的遺傳差異而被廣泛應用。目前，在植物育種中使用的分子標記很多，其中，SSR標記(簡單重復序列，Simple Sequence Repeat)因其多態性豐富，遺傳上呈共顯性， 重復性好，且覆蓋整個基因組的編碼區和非編碼區，目前已被廣泛用于作物品種指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析中。馬軒，等(2003)、潘兆娥，等(2010)、李成奇，等(2011)、孫寧，等(2011)、匡猛，等(2011)、趙亮，等(2012)、馮艷芳，等(2015)利用SSR分子標記分別構建了“18個彩色棉品系、中棉所48、百棉系列棉花自交系品種(系)、2009年度黃河流域國家棉花區試57份參試品材料、2008年中國3大棉區8個棉花主產省份32份棉花主栽品種、12個不同來源系統的棉花品種、20份新疆棉花品種”的DNA指紋圖譜以及進行遺傳多樣性分析。

本研究擬通過對新疆190份棉花材料進行遺傳多樣性評價，為育種家在種質資源創制、親本有效選配和品種合理種植提供有效參考，使雜交親本的選擇更有針對性，減少配置雜交組合的盲目性，提高雜交后代育種選擇效率，從而加快棉花新品種的選育。

1 材料與方法

1.1 材料

190份不同的棉花種質材料均來自于新疆的農家種，包括80份北疆主栽棉花品種和110份南疆主栽棉花品種；根據山東棉花中心前期研究的報道，選取26個棉花基因組SSR標記用于本次實驗研究。SSR引物由北京擎科生物科技有限公司。

1.2 田間試驗設計與性狀調查

2021年，80份北疆主栽棉花品種種植于新疆昌吉州瑪納斯縣六戶地鎮陳家渠村，膜幅寬2.05 m，一膜6行，行距為66 cm和10 cm模式，株距9.5 cm，密度為277020 株/公頃， 拖拉機將地膜滴灌帶鋪好，機械膜上打孔劃區人工點播；110份南疆主栽棉花品種種植于庫爾勒市阿瓦提農場4分場，密度為205125 株/公頃。田間大田管理方法均同常規大田；吐絮后，收花軋花考種，考種后每個材料稱取20 g棉樣，寄送農業部棉花品質監督測試中心(安陽)利用 HVI1000 測定，采用 HVICC 國際校準棉樣，測定纖維上半部平均長度、整齊度指數、斷裂比強度、馬克隆值和伸長率5項纖維品質指標。

1.3 DNA提取和PCR擴增

在培養箱中種植供試材料，溫度28℃，光照 16h/8h 黑暗，濕度60%。兩葉一心期，每個供試材料隨機選取三株，每株取幼嫩新鮮的葉片混合于2 ml的EP管內，加入700 uL提取液，并在每一管中加入一粒鋼珠，用全自動樣品快速研磨儀研磨180 s，最后利用改良的CTAB法提取棉花基因組DNA。DNA純度和濃度使用多功能酶標儀(SparkTM 10M)檢測。

PCR反應體系為10 μL：DNA模板2 μL，2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)5.0 ul，前后引物各0.5 μL，ddHO 2.0 μL。本實驗使用的2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)購于南京諾唯贊生物技術公司，包含3G Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、可視化紅色染料和優化的緩沖體系；PCR熱循環程序：第一步，95℃預變性5 min，第二步，94℃變性30 s，第三步，55℃退火45 s，第四步，72℃延伸1 min，第二步到第四步30個循環，第五步，72℃延伸10 min，10℃保存。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

PCR擴增產物的檢測在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測，具體操作步驟如下：把成套的兩塊干凈的玻璃板對齊，平放，兩邊用夾子夾緊，至于平板上；用玻璃棒引流，緩慢倒入8%的聚丙烯酰胺凝膠(29∶1)，插入梳子，放置15 min；待膠凝固后，松掉夾子，把有凝膠的玻璃板裝入電泳槽中，倒入1×TBE電泳緩沖液，并用夾子兩邊加緊，繼續加入電泳緩沖液，沒過凝膠，拔梳子；點樣(上樣量為1 μL)，180 V恒壓環境下電泳1.5 h。讀帶標準：對于同一引物在190個品種中擴增出的條帶，帶型占多數的帶型記錄為1，其余記錄為2、3、4等。

1.5 數據統計

190份棉花材料農藝性狀的最小值、最大值、平均數、標準差以及變異系數等描述性統計信息使用 Microsoft Excel 2016 進行分析，并使用 Shannon 多樣性指數衡量研究上述材料的遺傳多樣性，公式為： H′ = -∑PLnP；采用POPGENE 32軟件計算基于26對SSR分子標記的群體等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)和多樣性指數(Shannon，H′)等。使用PowerMarker 3.25計算主要等位基因頻率(Minor Allele frequencies, MAF)和多態性信息量(polymorphism information content，PIC)等，并根據Nei's分子遺傳距離進行非加權組平均法(Unweighted Pair-group Method With Arithmetic Means, UPGMA)聚類分析，最終使用MEGA 5.2 軟件繪制樹形聚類圖。

2 結果與分析

2.1 表型性狀的遺傳多樣性分析

收集的新疆190份棉花資源在8個主要性狀上呈現較大的變幅度范圍(表1)，籽棉產量最大值為7674.00 kg/hm，最小值為1250.10 kg/hm，平均值為5589.61 kg/hm，變異幅度為6423.90 kg/hm；皮棉產量最大值為3551.25 kg/hm，最小值為390.00 kg/hm，平均值為2337.25 kg/hm，變異幅度為 3161.25 kg/hm；衣分最大值為54.93%，最小值為28.90%，平均值為41.15%，變異幅度為26.03%；纖維長度最大值為40.00 mm，最小值為26.90 mm，平均值為32.35 mm，變異幅度為13.10 mm；斷裂比強度最大值為53.00 cN/tex，最小值為26.00 cN/tex，平均值為35.48 cN/tex，變異幅度為27.00 cN/tex；馬克隆值最大值為 5.50，最小值為3.30，平均值為4.40，變異幅度為2.20；纖維整齊度最大值為89.30%，最小值為80.50%，平均值為85.12%，變異幅度為8.80%；纖維伸長率最大值為14.00%，最小值為2.80%，平均值為6.79%，變異幅度為11.20%。

新疆190份棉花資源在8個主要性狀上呈現較為豐富的表型變異(表2)，變異系數(CV)范圍為2.06%～25.62%，其中3個產量相關性狀中，皮棉產量(25.62%)的變異系數最高，超過了20%，而籽棉產量和衣分的變異系數分別為18.73%和12.13%。與纖維品質相關的5個性狀，變異系數變化范圍較大，為2.06%～22.13%，其中斷裂比強度的變異系數最大(22.13%)，依次為伸長率(16.70%)、上半部平均長度(11.52%)和馬克隆值(10.88%)，而整齊度指數的變異系數最小(2.06%)。香農(Shannon)多樣性指數范圍為1.4771～2.0631，以纖維整齊度的最高，纖維斷裂比強度的最低，7 個纖維性狀指標的Shannon多樣性指數均高于1.4000。

表1 新疆190份棉花材料主要性狀的統計參數

表2 新疆190份棉花材料主要性狀的多樣性情況

2.2 SSR 核心引物擴增位點

利用26 對SSR 核心引物在新疆190份棉花材料中累計檢測到179個等位基因位點，等位基因位點變幅度范圍為3～14個，平均為6.88個(表3)；累計有效等位基因數(Ne)為96.5017，變幅范圍為2.2284～6.0081，平均值為3.7116；主要等位基因頻率(MAF)的變幅范圍為0.2849～0.5632，平均值為0.4084；基因多樣性指數變幅度范圍為0.5512～0.8336，平均值為0.7150；多態性信息含量(PIC)值的變幅度范圍為0.4525～0.8147，平均值為0.6714，Shannon 多樣性指數(H′)變幅度范圍為0.9221～2.0435，平均值為1.4562。

2.3 基于26個SSR標記的聚類分析

利用26個SSR分子標記信息對新疆190份棉花材料進行Nei's分子遺傳距離計算，并構建復合的一致性系統進化樹，將其分為8個類群，其中類群Ⅰ包含38份材料，類群Ⅱ包含19份材料，類群Ⅲ包含27份材料，類群Ⅳ包含21份材料，類群Ⅴ包含18份材料，類群Ⅵ包含31份材料，類群Ⅶ包含12份材料，Ⅷ包含24份材料(圖1)。

表3 新疆190份棉花材料 26個SSR位點的遺傳多樣性信息

8個類群在3個產量性狀(籽棉產量、皮棉產量和衣分)的平均值范圍分別為3468.67～6261.15 kg/hm、1486.97～2803.6 kg/hm和32.43%～44.61%，其中類群Ⅰ在3個產量性狀指標中最小，類群Ⅷ最大；纖維品質相關的5個性狀指標中，纖維上半部平均長度和斷裂比強度在8個類群的平均值范圍分別為29.52～39.04 mm和29.45～50.22 cN/tex， 類群Ⅳ最小，類群Ⅰ最大，馬克隆值的平均值范圍為4.11～4.80，類群Ⅰ最小，類群Ⅳ最大，纖維整齊度指數和伸長率的平均值分別為84.16%～87.46%和6.12%～7.53%，類群Ⅴ最小，類群Ⅰ最大(圖1，表4)。

表4 新疆190份棉花材料各類群主要性狀的平均值統計

3 結論和討論

遺傳多樣性分析是作物種質資源評價的重要方面，可以為育種家們在種質資源創新和親本選配過程中提供有力參考，使雜交親本的選擇更有針對性，從而提高雜交后代育種選擇效率。本研究對新疆190份棉花材料進行了表型性狀的遺傳多樣性分析，8個主要性狀呈現出較為豐富的表型變異，表型變異系數范圍為2.06%～25.62%，香農(Shannon) 多樣性指數范圍為1.4771～2.0631， 其中7 個性狀的香農(Shannon)多樣性指數均高于1.4000。綜上數據說明，190份棉花材料表現出了較高的遺傳多樣性，資源類型比較豐富，利于特異種質資源的篩選和核心種質的提取。

分子標記能夠從DNA水平反映生物個體間基因組中的某些差異，且不受環境影響，被廣泛應用于作物的遺傳多樣性分析和品種間的親緣關系鑒定。本研究利用26對SSR核心引物對新疆收集的190份棉花材料進行遺傳多樣性分析，基因多樣性指數變幅度范圍為0.5512～0.8336，多態性信息含量(PIC)值的變幅度范圍0.4525～0.8147，香農(Shannon)多樣性指數(H′)變幅度范圍為0.9221～2.0435，說明SSR標記的遺傳信息比較豐富，190份棉花材料在DNA水平存在一定的遺傳多樣性。

基于26個SSR分子標記信息，本研究對新疆190份棉花材料進行了Nei's分子遺傳距離計算，將其分為8個類群，除了類群Ⅰ與其他7個類群分子遺傳距離較遠外，其余7個類群分子遺傳距離較小。8個類群在8個主要性狀上呈現較為豐富的表型變異， 3個產量性狀(籽棉產量、皮棉產量和衣分)的平均值范圍分別為4468.67～6261.15 kg/hm、1486.97～2803.6 kg/hm和32.43%～44.61%，5個纖維品質性狀(上半部平均長度、斷裂比強度、馬克隆值、纖維整齊度指數和伸長率)在8個類群的平均值范圍分別為29.52～39.04 mm、29.45～50.22 cN/tex、4.11～4.80、84.16%～87.46%和6.12%～7.53%。 類群Ⅰ的纖維上半部平均長度、斷裂比強度、整齊度指數和伸長率最優，而籽棉產量、皮棉產量和衣分較低；類群Ⅷ的籽棉產量、皮棉產量和衣分較高，而纖維上半部平均長度和斷裂比強度最低。遺傳相似系數聚類分析結果反映了新疆190份棉花材料之間的親緣關系，今后應將更豐富的形態信息與分子數據結合在一起形成指紋圖譜，使品種信息更加全面、準確，從而為后續棉花種質資源創新和新品種選育提供了科學依據。

圖1 基于SSR標記數據的新疆190份棉花材料的遺傳聚類圖