雞毒支原體滅活疫苗效力檢驗氣囊注射攻毒方法的研究

魏 津，劉 博，馬 欣，王 甲，趙浩然，劉元杰，馮 妍，劉業兵，羅玉峰

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

雞毒支原體(Mycoplasmagalliscepticum，MG)是致病性最強、引起損失最大的禽支原體，主要導致雞慢性呼吸道疾病(Chornic respiratory disease，CRD)[1]，以呼吸道啰音、咳嗽、流鼻涕為主要癥狀，部分表現為結膜炎、眶下竇炎。CRD雖然致死率不高，但嚴重影響家禽產蛋率、孵化率和飼料轉化率，給養殖企業造成重大經濟損失[2]。臨床中由于長期使用或濫用抗菌藥物，導致雞毒支原體耐藥菌株不斷增加，給通過藥物防控該病帶來困難，甚至危及食品安全[3]，因此疫苗免疫是防控該病的重要手段，國內市場上占主導地位的是雞毒支原體滅活疫苗[4]。效力檢驗是評價疫苗質量的最核心手段，《中國獸藥典(2020年版三部)》中收錄的該疫苗質量標準的效力檢驗采用免疫攻毒法，攻毒方式為噴霧[5]。該方法需要制備500-600 mL的攻毒培養物，經過菌種復蘇、擴大培養、活菌預計數和攻毒菌液計數等步驟，且活菌計數周期長，攻毒感染劑量不易控制，對操作人員的經驗和技術要求高。同時，攻毒結果易受器械設備的影響較大，噴霧操作后消毒難度較大，存在生物安全隱患。為此，本研究通過將雞毒支原體檢驗用攻毒菌種制備成方便使用和保存的凍干攻毒培養物，進行氣囊注射攻毒試驗和比較研究，旨在建立一種更加科學準確、操作簡便的攻毒方法，也為相關標準品的研究制備提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種 雞毒支原體R株(CVCC 1651)由中國獸醫藥品監察所鑒定、保存和供應。

1.2 材料與試劑 硫乙醇酸鹽流體培養基(TG)、胰酪大豆胨液體培養基(TSB)、12%明膠40%蔗糖保護劑均購自北京中海生物科技有限公司。圓形滅菌濾紙片，購自oxoid公司。雞毒支原體抗血清，實驗室保存。CM液體和固體培養基由實驗室自制。

1.3 實驗動物 SPF雞購自北京勃林格殷格翰有限公司。

1.4 方法

1.4.1 凍干培養物制備

1.4.1.1 菌種擴繁 將-20 ℃保存的雞毒支原體R株凍干菌種用1 mL CM液體培養基復溶后，按一定比例接種到CM液體培養基中37 ℃培養24 h后，按一定比例接種培養基連續傳代，第3代菌液經純粹檢驗和活菌計數后待用。

1.4.1.2 分裝凍干 取生長良好，有輕度混濁，無沉淀的第3代菌液，按總體積10%比例加入保護劑，充分混勻后分裝至安瓿瓶內凍干，凍干后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 凍干培養物的鑒定

1.4.2.1 常規檢驗 對凍干培養物進行性狀、純粹檢驗、剩余水分、真空度、培養特性和活菌計數檢驗。

1.4.2.2 特異性試驗 代謝抑制試驗：用CM液體培養基對雞毒支原體R株培養物進行10倍系列稀釋到10-5，取1 mL稀釋好的菌液，加入含雞毒支原體抗血清0.05 mL(終濃度為5%)的CM培養基1 mL，同時設加陰性血清的小管為陽性對照，空白培養基作為陰性對照，置于培養箱37 ℃培養14 d，觀察培養基顏色變化。生長抑制試驗：取直徑6 mm的圓形滅菌濾紙片，用未經稀釋的雞毒支原體抗血清濕透后，放入無菌平皿內，置于2～8 ℃干燥待用。將R 株培養物各0.3 mL分別接種到2個CM固體培養基，均勻鋪開，放置37 ℃培養箱使培養基表面稍干燥。用滅菌小鑷子夾取抗血清紙片貼在固體培養基表面靠中間位置，另一個固體培養基貼空白紙片作為對照，置于培養箱37 ℃培養10 d后在顯微鏡下觀察結果。

1.4.3 瓶間活菌數均一性試驗 隨機抽取10瓶凍干培養物，使用顏色變化單位(簡稱CCU)分別對其進行活菌計數，比較活菌數的差異。

1.4.4 氣囊注射攻毒方法的建立 將凍干培養物復溶后，根據凍干后活菌計數結果進行10倍倍比稀釋為10-1、10-2，將原液和每個稀釋度進行活菌計數后分別取0.2 mL和0.4 mL氣囊注射10只75日齡SPF雞。制備雞毒支原體R株的培養物550 mL，進行活菌計數后在隔離器內噴霧攻擊10只75日齡SPF雞。另取10只雞，5只氣囊注射0.4 mL培養基作為氣囊注射對照組，5只用培養基進行噴霧作為噴霧對照組。7 d后記錄活菌計數結果，確定實際攻毒劑量。14 d后將所有組別的雞剖檢，記錄氣囊病變分數結果，氣囊病變記分標準參照《中國獸藥典(2020年版三部)》“雞毒滅活疫苗質量標準附注”[5]。將氣囊注射與噴霧攻毒的結果進行單因素方差分析。

1.4.5 氣囊注射攻毒方法的評價 用噴霧和1.2.4項確定的氣囊注射兩種攻毒方法同時對5家企業5個批次的疫苗進行兩次效力檢驗。每批疫苗取1瓶搖勻后免疫56日齡SPF雞8只，1 mL/只。免疫30天后攻毒，比較兩種方法的對照組氣囊病變分數情況和平均氣囊保護率，記分標準及計算方法參照《中國獸藥典(三部)》“雞毒滅活疫苗質量標準附注”[5]，評價利用氣囊注射攻毒方法對滅活疫苗效力檢驗的可行性。

2 結果與分析

2.1 常規檢驗 凍干的165支菌種中，5支無輝光，160/165呈現白色或紫色輝光，真空度良好。純粹檢驗結果符合規定，水分測定結果為0.7%、1.4%、0.2%、0.7%，均不超過4.0%。活菌計數結果為109CCU/mL，培養菌落呈典型的“油煎蛋”狀外觀，符合培養特性的規定。

2.2 特異性試驗 代謝抑制試驗：加抗血清的培養基小管未變色，加陰性血清的培養基小管變黃，培養基對照管未變色。生長抑制試驗：抗血清紙片周圍無菌落生長，出現大于2.0 mm的抑菌圈；空白紙片的平板有菌落生長，沒有抑菌圈，說明該菌種為雞毒支原體，符合規定。

2.3 瓶間活菌數均一性試驗 10瓶凍干培養物活菌數均為109CCU，變異系數為0%。

2.4 氣囊注射攻毒方法的建立 噴霧攻毒用培養物活菌數為109CCU/mL，凍干培養物活菌數為109CCU/mL，稀釋后復數結果10-1、10-2兩個稀釋度對應的活菌數為108CCU/mL和107CCU/mL。不同攻毒方法的氣囊病變分數結果見表1：氣囊注射0.2×107CCU和0.4×107CCU的培養物，6/10和5/10分別出現2分以上的典型氣囊病變，不符合菌種毒力標準的發病要求[6]；噴霧組方差大于氣囊注射的6個實驗組(方差反映一組數據的離散程度)，說明噴霧組分數差異大，感染劑量不均一。將不同攻毒方法的病變分數進行單因素方差分析，結果見表2：在顯著水平α=0.05時，氣囊注射0.4×109CCU、0.2×108CCU和0.4×108CCU的F值均大于F臨界值，P值小于0.05，與噴霧結果差異顯著；氣囊注射0.2×109CCU的F值均小于F臨界值，P值大于0.05，與噴霧結果無顯著差異。

表1 不同攻毒方法的氣囊病變分數結果Tab 1 Air sac leision scores of different challenge methods

表2 不同劑量氣囊注射與噴霧攻毒方法氣囊病變結果方差分析Tab 2 Variance analysis of aerosol challenge and air sac injection with different doses

2.5 氣囊注射攻毒方法的評價 2.4項結果表明，氣囊注射0.2 mL 109CCU/mL的凍干培養物與現行噴霧方法無顯著差異，選用該攻毒劑量進行氣囊注射攻毒。兩次效力檢驗攻毒對照組氣囊病變分數結果見表3：兩次氣囊注射攻毒分數無明顯差異，和噴霧方法相比，分數也無明顯差異。

表3 不同攻毒方法兩次效力檢驗的氣囊病變分數Tab 3 Air sac leisions scores of different challenge methods in two potency tests

兩次效力檢驗結果比較見表4。結果表明，5家企業5批產品采用兩種攻毒方法進行效力檢驗平均氣囊保護率無明顯差異，檢驗結果符合率100%。

表4 不同攻毒方法兩次效力檢驗的結果比較Tab 4 Comparative results of different challenge methods in two potency tests

3 結論與討論

目前國內外雞毒支原體滅活疫苗效力檢驗均采用噴霧攻毒法。在雞毒支原體的研究過程中，有多種方法用于雞的攻毒感染試驗，包括鼻、眼、竇和氣管內的接種[7]，氣囊注射[8]、氣霧攻毒[9]、肺內注射[10]。據賴月輝等2018年報道[11]氣囊攻毒的病變比肺內攻毒出現的病變更典型，效果更好，具有良好的重復性。采用氣囊注射具有易定位、易操作和接種量更精確的優點，直接感染氣囊，避免了噴霧攻毒試驗雞由于吸入量可能不同導致感染劑量不均一，發病情況差異大的問題。同時，采用注射攻毒，所需培養物量少，易于制備，并利于隔離器消毒處理，大大降低了生物安全隱患。

采用新鮮培養物攻毒，需要每次預培養摸索攻毒菌株在該批培養基的生長曲線，并據此重新培養進行攻毒，兩次培養條件和結果很難達到完全一致，有可能會對效力評價結果產生一定影響。本研究制備了凍干攻毒用培養物，保存于-80 ℃，通過攻毒試驗確定了攻毒劑量，應用于兩次雞毒支原體疫苗效力檢驗中，結果表明，在此段時間內活菌數和毒力均保持穩定，且效力檢驗結果與噴霧方法無顯著差異。將其應用于效力檢驗將減少復蘇強毒菌種和再培養等步驟，降低工作量。每次采用同一批攻毒用凍干培養物，提高了檢驗結果的準確性和可重復性，提升了檢驗效率，為研制攻毒用標準品提供實驗依據。

未來可通過不同保存條件、保存時長內活菌數和毒力穩定性的監測，確定本研究中凍干培養物的保存要求和時限。同時可考慮篩選一種新的凍干保護劑，提高其在不同溫度環境存放的穩定性并延長保存期，實現對外供應，為提高雞毒支原體疫苗效力評價水平奠定基礎。