基于納米材料的免疫層析試紙在獸藥殘留檢測中的應用

楊婭林，陸彥蓉，殷曉陽，李華明，彭大鵬

(華中農業大學，中國農業科學院深圳農業基因組研究所，國家獸藥殘留基準實驗室，武漢 430070)

獸藥，尤其是抗微生物藥物，大量用于動物疾病的治療、預防以及飼料添加劑，其殘留會影響人或動物的健康，如出現過敏反應、耐藥性增強、生殖危害及癌癥等。快速檢測是保證食品安全，減少獸藥殘留的重要手段，儀器分析法[1]、酶聯免疫吸附法(ELISA)[2]是目前常用的檢測方式。儀器分析法的操作專業性、對使用場所的要求限制了其現場檢測的發展，ELISA盡管具有現場檢測優勢，但繁瑣的操作過程，無法完成大規模食品篩選，且檢測結果易受到環境影響。免疫層析試紙主要由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊及底板構成，以標記材料的特殊性質作為檢測信號，檢測卡的使用形式不受限于場所、操作人員，具有操作簡單、檢測時間短、靈敏度高及成本低等優勢，是實現現場檢測、大量樣品篩選的重要方法。因此，文章以膠體金、量子點、磁性納米材料、時間分辨熒光微球作為綜述對象，對他們的優缺點以及在獸藥殘留檢測中的應用進行闡述，展望免疫層析試紙技術未來應用趨勢，以期提供新的發展思路，保證食品安全。

1 基于膠體金納米材料的檢測方法

膠體金(Colloidal gold，CG)主要通過還原氯金酸制備而成，以靜電吸附方式與蛋白質結合而不改變其生物特性，在硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上與抗原發生特異性反應后，膠體金聚集顯示紅色，最終通過對比檢測線間顏色深淺判定陰性、陽性的檢測結果(圖1)。

圖1 膠體金試紙檢測原理(A)、結果判定方法(B)Fig 1 Colloidal gold assay strip principle(A)、result reading method(B)

基于膠體金納米材料的免疫層析方法在獸藥殘留檢測領域有著重要地位。在已發表的免疫層析相關文獻中，約有75%的標記材料都是膠體金[3]。如表1所示，目前膠體金試紙的檢測范圍幾乎包括所有的抗微生物藥物種類，檢測樣品涉及到水產品、肉類、禽蛋、乳制品等動物源性食品，以及尿液、血清等生物樣品，3～20 min可完成檢測，除此以外，膠體金試紙已實現多種藥物聯合檢測，可基本滿足大規模的食品篩選。

表1 膠體金免疫層析試紙的應用Tab 1 Application of colloidal gold immunochromatographic assay strip

傳統的膠體金免疫層析試紙主要通過肉眼對比檢測線顏色深淺判定結果。這種判讀方式往往受檢測人員主觀意識影響，檢測結果差異大，檢測靈敏度有限。為提高檢測的靈敏度和準確性，研究人員將銀離子沉積在金粒子表面[15]，或將球形金粒子改變為爆米花或納米星形狀[16]，增強膠體金的視覺可見性，以此減小檢測誤差，檢測靈敏度可提高5～10倍以上。另一方面，研究者也開發出光學檢測儀代替肉眼判讀，將C、T線的色密度轉化為光密度進行處理，由于色密度信號僅來自于NC膜表面10 μm，其中約有90%的信號因光散射、折射等原因出現損失[17]，所以這種信號轉化后的結果準確性尚有待提高。

2 基于磁性納米材料的檢測方法

磁性納米材料(Magnetite nanoparticles，MNPs)，是一類特殊的納米級氧化物，可以通過物理法、化學法、生物法等多種途徑合成，剛合成的磁性粒子經過表面修飾后，可以增強粒子的物理、化學穩定性，同時提供便于蛋白質偶聯的官能團。MNPs有著與膠體金相當的摩爾吸光系數，標記抗體后，與NC膜上的特異性抗原反應顯示棕黃色。但如上所述，光學信號易產生損失，NC膜幾百微米的實際厚度，以及生物樣本中的有色成分，也會影響光學信號的獲取。磁信號則不會受到這些因素的影響，同時生物樣本幾乎無磁性，磁珠富集后的磁信號可被準確測量，因此磁性試紙有著更高的準確度、靈敏度。孫虹[18]使用MNPs作為標記物檢測養殖用水、魚肉中的孔雀石綠殘留，25 min可獲得檢測結果，定量限為0.6、0.9 μg/L，與市售膠體金試紙經檢測對比后，該磁性試紙具有更高的靈敏度。此外，磁性試紙特異性更強，相比于傳統的儀器分析法，耗時更短且操作簡單。Yan[19]在檢測呋喃唑酮分析物時，用MNPs分別標記單克隆抗體、羊抗鼠抗體，利用兩種抗體的特異性結合，起到信號增強作用，檢測限低至0.044 μg/L，磁性試紙檢測靈敏度進一步提高5～10倍。雖然MNPs的合成方法較多，卻依舊缺少成熟、穩定的合成途徑，適用于免疫層析的MNPs較少，因此，在獸藥殘留檢測中很難看到磁性試紙，昂貴的進口檢測儀器也是制約因素之一。

表2 磁性免疫層析試紙的應用Tab 2 Application of magnetic immunochromatographic assay strip

MNPs經修飾后仍能表現出優異的磁性，只需外加磁場就可實現溶液中磁珠快速分離，對于其他納米材料，磁性特性使MNPs在免疫層析試紙上應用更廣泛，例如檢測前的樣品處理。免疫層析試紙無法對待測物進行精準選擇，加之檢測形式簡單，動物樣品中的蛋白、脂肪等基質易對檢測結果產生干擾。MNPs經蛋白質修飾后，可與目標分析物特異性結合，通過外加磁場實現目標分析物的快速分離，合適洗脫后可得到高純度目標分析物，被稱為磁分離技術(圖2)，利用該技術處理樣品可大幅減少有機溶劑使用，洗脫后的MNPs還可重復利用，具有環保、經濟優勢，是磁性納米材料除標記材料的特殊應用。Zhang[25]使用該技術處理粗樣品，最終獲得高純度氯霉素類似物，整個過程簡單、快速，可有效提高后續檢測準確性。于是，研究者便將磁分離技術與膠體金試紙條結合(表2)，相比于傳統處理方式，這種結合模式，能有效提高膠體金試紙靈敏度10倍以上。

圖2 磁分離技術Fig 2 Magnetic separation technology

3 基于量子點的檢測方法

量子點(Quantum dots，QDs)是由Ⅱ-Ⅵ族元素、Ⅲ-Ⅴ族元素或Ⅳ-Ⅵ族元素組成，具有發光特性的一種半導體納米晶體，比羅丹明、熒光素等傳統熒光染料，吸收波長更大，熒光強度更高，常使用以CdSe、CdS或CdTe為核心，ZnS或ZnSe鈍化后的核殼量子點作標記材料。

Beloglazova[26]對牛奶樣本僅采用稀釋處理，檢測其中的慶大霉素殘留，對量子點試紙、膠體金試紙的檢測效果進行對比。結果表明，QDs檢測靈敏度比CG高5倍，量子點試紙假陽性率、假陰性率分別為2.4%、2.1%，均低于膠體金試紙(4.3%、3.2%)。這是因為QDs與抗體共價連接，比靜電吸附作用更加牢固，因此，抗干擾能力更強，且熒光信號較光學信號更易區分陽性、陰性結果，借助熒光信號檢測儀器，可以獲得更低檢測限。

Taranova[27]使用525 nm(綠色)、585 nm(黃色)、625 nm(紅色)三種不同顏色的QDs作檢測信號，檢測牛奶中氧氟沙星、氯霉素、鏈霉素三種藥物殘留，檢測限分別為0.3、0.12、0.2 μg/mL，檢測誤差低于8%，10 min就能完成三種藥物檢測，因檢測過程中，熒光顏色的變化形似紅綠燈，又被稱為“紅綠燈”信號試紙(圖3)。QDs可以通過改變其合成成分、粒徑，在相同波長激發時表現多色熒光，這一特性讓QDs在多種藥物同時檢測中，仍能保持良好區分性，為不同藥物的準確定量提供了保證。

圖3 多色熒光試紙(A)、鏈霉素陽性(B)、氧氟沙星和氯霉素陽性(C)Fig 3 Multicolor fluorescence assay paper(A)、Streptomycinpositive(B)、Ofloxacin and Chloramphenicol positive(C)

如表3所示，量子點試紙已應用于肉類、奶制品及生物樣品的檢測，在萊克多巴胺，以及鏈霉素、四環素、青霉素聯合檢測中，檢測限低至ng量級。盡管如此，研究者發現某些蛋白質或溶劑分子會使QDs熒光強度下降或淬滅，于是研究者將大量QDs包裹在聚苯乙烯、二氧化硅等納米微球內，以增強QDs熒光穩定性。同時，納米微球包裹技術可以一定程度上隔絕Cd元素，避免生物毒性。InP、CuInS2、Ag2S等無鎘量子點，因無毒、環保優勢逐漸成為研究熱點，Beloglazova[28]首次成功制備InP/ZnS無鎘量子點試紙，可以靈敏檢測兩種霉菌毒素，方法簡單且經濟高效，但因無鎘量子點制備困難，因此未在獸藥殘留檢測廣泛應用。

表3 量子點免疫層析試紙的應用Tab 3 Application of quantum dot immunochromatographic assay strip

4 基于時間分辨熒光微球的檢測方法

時間分辨熒光微球(Time-resolved fluorescence microsphere，TRFM)，是將鑭系元素絡合物封裝在聚苯乙烯，或二氧化硅納米微球中的一種新型微球，可以提供穩定、高強度的熒光信號，常用Eu(Ⅲ)系熒光微球。TRFM具有更大的Stokes位移，熒光穿透力、抗干擾能力更強，不易出現熒光淬滅現象，與非特異性熒光背景區分性好，幾乎無生物毒性。

如表4所示，Li[35]首次構建Eu(Ⅲ)元素時間分辨熒光試紙，檢測地塞米松殘留，牛奶、豬肉的定量限分別為0.003 μg/L、0.062 μg/kg，10 min可完成檢測。Wang[36]制備的TRFM試紙，氯丙嗪檢測限為0.32 μg/kg，線性范圍更寬(0.46～10.0 μg/kg)，線性關系較好(R2=0.991)，樣品預處理后，6 min內就可完成檢測。可見，TRFM具有較高的檢測靈敏度，能夠對獸藥殘留檢測進行定量檢測。

表4 時間分辨熒光微球免疫層析試紙的應用Tab 4 Application of time-resolved fluorescent microsphereimmunochromatographic assay strip

Hu[29]首次對TRFM、乳膠微球、QDs、CG的靈敏度及標記消耗量進行系統比較。同比于量子點試紙，時間分辨熒光試紙靈敏度提高3～4倍，為7.2 ng/L。乳膠微球、QDs和CG抗體標記量分別是0.02、0.054和 0.15 μg， TRFM抗體標記量僅為0.005 μg。時間分辨熒光試紙T線包被抗原濃度0.4 mg/mL，其余三種試紙T線包被抗原濃度0.8 mg/mL。同時，時間分辨熒光試紙檢測范圍最大，檢測時間最短，準確度最高，檢測結果與LC-MS/MS、商品化ELISA試劑盒一致。

綜上所述，時間分辨熒光試紙靈敏度更高、檢測范圍更大、抗原抗體消耗更少，能夠為獸藥殘留檢測提供新型、高效、經濟的檢測方式。目前，時間分辨熒光試紙在獸藥殘留檢測的應用處于起步階段，這是因為TRFM的生產技術不成熟，仍需依賴商品化微球，而商品化微球還存在分散性、熒光強度不穩定現象。

5 展 望

綜上，每種納米材料的優缺點如表5所示。納米材料為免疫層析試紙提供了特殊檢測信號，大幅提高免疫層析試紙檢測靈敏度，并實現定量分析，其中MNPs因特有的磁性特性，為免疫層析試紙提供新的樣品處理方式，以保證結果準確性。

表5 納米材料特點Tab 5 Characteristics of Nanomaterials

基于此，為應對動物食品中多種藥物及其代謝物殘留現狀，免疫層析試紙還應具備多重分析功能，經總結多重分析試紙主要有以下幾種應用趨勢：

5.1 多檢測線試紙 多檢測線是指增加檢測線數量，在一條試紙上檢測不同藥物(圖4A)。為防止檢測線互相干擾，需要靈敏度、特異性更強的抗體，由于免疫探針在流動過程中，易出現稀釋、反應緩慢等現象，進而會影響藥物檢測靈敏度，因此，待測物至檢測線距離應著重考慮。

5.2 多通道檢測 多通道檢測是將檢測同種、不同種藥物的試紙條，組裝在一個檢測平臺的檢測方式，每一條試紙擁有單獨加樣槽、閱讀窗，可根據檢測需求，增減平臺試紙數量，是當前商品化多重分析試紙的主要檢測方式(圖4B)。

5.3 矩陣檢測 相同區域下，點狀在數量上更具優勢，將線性檢測線用點陣代替，可極大增加檢測數量，抗原包被數量可達32種(圖4C)。目前，矩陣檢測試紙已在傳染病診斷、病原體檢測中應用，但由于檢測區域縮小，易受液體流速不均等外界因素干擾，尚無法保證結果準確性，在獸藥殘留檢測中應用較少。

圖4 多檢測線試紙(A)、多通道檢測(B)、矩陣檢測(C)Fig 4 Multi-detection line assay paper(A)、Multi-channeldetection(B)、Matrix detection(C)

定量分析是保證檢測結果準確的重要手段。MNPs、QDs和TRFM的應用，實現了數據化處理、存儲和運輸，結果準確性大大提高。2010-2019年間，免疫層析試紙在食品安全中的應用量快速增長。其中，傳統比色法試紙使用量減少，定量分析試紙使用量增多且呈幾倍增長，這得益于信號檢測儀器的開發與應用，為滿足現場快檢需求，這些檢測儀器逐漸趨向于小型化、便攜化。大眾食品安全意識的提高，將帶來家庭檢測需求，智能手機的普及與發展，將促進家庭化、智能化、大眾化的新型閱讀方式形成，不斷推動獸藥殘留檢測技術發展。