基于網絡藥理學探討馬針顆粒治療仔豬腹瀉的作用機制

曲雪嘉，李涪鋅，王春花

(牡丹江師范學院生命科學學院，黑龍江牡丹江 157000)

仔豬腹瀉為規模化養殖場斷奶仔豬最常見疾病。產腸毒素大腸桿菌是早期斷奶仔豬腹瀉高發的重要誘因之一，由于藥物的不規范使用，導致臨床上的大腸桿菌普遍耐藥。中藥具有低毒低耐藥等特點，馬針顆粒由馬齒莧、三顆針兩味中藥組成，為我國三類新獸藥，臨床研究發現馬針顆粒對仔豬黃、白痢治愈率高達100%[1-3]，但其藥效成分與作用機制目前并不十分清楚。

中藥成分多而復雜，網絡藥理學技術為中藥研究的難點與瓶頸問題提供了新的思路與方法[4-8]。網絡藥理學是以系統生物學和多向藥理學理論為基礎，采用生物分子網絡分析的方法，為中醫藥治療疾病機理的研究與闡述提供了新途徑。它突破傳統的“一個基因一個藥物一個疾病”理念，從系統層面揭示中藥對機體調控網絡作用[9-10]。目前，網絡藥理學技術在中獸藥與中藥功能性飼料添加劑領域的應用還處于初始階段，值得深入探索，具有可觀的應用前景。本研究基于網絡藥理學技術，通過對馬針顆粒成分、靶點、生物功能、調控通路與靶點器官定位分析，探討馬針顆粒防控仔豬腹瀉的藥效物質基礎與作用機制，為馬針顆粒治療仔豬腹瀉機制的揭示及拓展應用范圍奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 馬針顆粒活性化合物構建靶點網絡 利用TCMSP(http:∥tcmsp-e.com)、Drugbank(https:∥www.drug bank.ca)數據庫進行檢索與收集馬齒莧與三顆針的化合物與靶點，依據Degree≥10靶點選取，應用Cytoscape3.7.1軟件構建化合物-靶點網絡，確定馬針顆粒的關鍵化合物與靶點。

1.2 馬針顆粒靶點蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 馬針顆粒靶點利用STRING數據庫(https:∥string-db.org)，物種選擇“sus scrofa”，打分值設置>0.9，進行分析馬針顆粒與仔豬腹瀉靶點間關系，刪除單個或無關的靶點后，應用Cytoscape3.7.1軟件構建PPI網絡，確定馬針顆粒治療豬腹瀉的重要靶點。

1.3 馬針顆粒靶點器官定位 通過BIOGPS數據庫(http:∥biogps.org/#goto=welcome)對馬針顆粒重要靶點(Degree值≥10)進行定位分析，保留基因表達量排名前3位的組織與器官，應用Cytoscape3.7.1構建馬針顆粒核心靶點-定位網絡。

1.4 馬針顆粒靶點GO富集及靶點KEGG通路富集分析 馬針顆粒靶點上傳到DAVID數據庫(http：∥david.ncifcrf.gov)，限定物種為“sus scrofa”，設定閾值P<0.05，進行GO(Gene ontology)生物學過程和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代謝通路富集分析，構建靶點-信號通路網絡，分析馬針顆粒治療豬腹瀉的調控通路。

2 結果與分析

2.1 馬針顆粒化合物-靶點相互作用網絡 見圖1。通過TCMSP、Drugbank數據庫收集、并去除無靶點化合物后收集到的18個馬針顆粒的化合物和423個作用靶點。馬針顆粒化合物-靶點網絡共包含441個節點，214條邊，平均每個化合物有23.5個靶點，根據化合物Degree值排名前5的成分主要為異甜菜甙(isobetanin_qt)、異甜菜素(isobetanidin)、花生四烯酸(arachidonic acid)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)、槲皮素(quercetin)，Degree值≥30的化合物為馬針顆粒關鍵成分(表1)。Degree值≥10的靶點為馬齒莧-三顆針關鍵靶點(表2)，根據靶點Degree值排名前5個關鍵靶點分別為溶解酵素(lysozyme)、CA2蛋白酶(Carbonic anhydrase 2)、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶pim-1(Proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Pim-1)、載脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)、視紫紅質(rhodopsin)。

箭形節點代表靶點，圓形節點代表馬針顆粒組方中藥化合物，箭形節點大小與Degree成正比，圓形節點顏色深淺(由紅到黃)與Degree值成正比圖1 化合物-靶點網絡圖Fig 1 Compound target network diagram

表1 馬針顆粒度值≥30的活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of active compounds with particle size value ≥30 of Ma Zhen Granule

2.2 馬針顆粒-豬腹瀉靶點蛋白PPI網絡 如圖2所示，PPI網絡馬針顆粒作用靶點與19個腹瀉靶點直接相關，其中包括TP53(腫瘤蛋白53)、MAPK3(絲裂原活化蛋白激酶3)、MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)、STAT1(信號轉導和轉錄激活子1)與NFKB1(核因子κB亞基1)5個豬腹瀉與馬針顆粒共有靶點。根據Degree值大小排名TP53、TNF(腫瘤壞死因子)、JUN(jun原癌基因)、CASP3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、MAPK14(絲裂原活化蛋白激酶14)、MAPK3、MAPK1、PPARG(過氧化物酶體增生激活受體γ)、MYC(myc癌基因)等，與豬腹瀉靶點相互關系最緊密，為馬針顆粒治療豬腹瀉的重要靶點(Degree>65)。

表2 馬針顆粒度值≥10的靶點基本信息Tab 2 Basic information of the target of Ma Zhen Granule equine needle particle size value ≥10

圖左側為仔豬腹瀉靶點，右側為馬針顆粒化合物靶點，中間為仔豬腹瀉與化合物的共同靶點，節點大小、顏色深淺(由紅到黃)與Degree值成正比圖2 馬針顆粒-關鍵靶點-疾病網絡Fig 2 Ma Zhen Granule -key target-disease network

2.3 靶點定位分析與歸經理論的相關性分析 如圖3所示，馬針顆粒重要靶點主要分布在空腸(Jejunum，Degree=6)，巨噬細胞(Macrophage，Degree=6)，骨髓(Marrow，Degree=5)，回腸(lleum，Degree值=4)，胸腺(Thymus，Degree=3)，十二指腸(Duodenum，Degree=2)，說明馬針顆粒在腸道、免疫功能中具有重要作用，這也馬針顆粒具有較好的仔豬腹瀉治療作用的主要原因。另外，馬針顆粒重要靶點在卵巢(Ovary，Degree=5)，胎盤(Placenta，Degree=3)，子宮(Uterus，Degree=2)的分布也較多，推測馬針顆粒可能在妊娠母豬應用中具有一定風險，具體具有何種風險能否應用于妊娠母豬值得進一步研究。

圖中橘色節點代表馬針顆粒重要靶點，紫色、綠色、湖藍色、深藍色、黃色節點代表各類組織器官圖3 馬針顆粒靶點-歸經網絡Fig 3 Target meridian network of Ma Zhen Granule

2.4 靶點通路分析 將馬針顆粒調控豬腹瀉的核心靶點蛋白輸入DAVID數據庫，GO功能富集分析得到GO條目114個(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目75個，占總比例的66%，分子功能(CC)條目16個，占14%，細胞組成(MF)相關條目23個，占20%，主要條目如圖4所示。

圖4 馬針顆粒靶點GO富集Fig 4 GO enrichment at Ma Zhen Granule targets

KEGG通路注釋分析，發現信號通路282條(P<0.05)，按P值排在前15的信號通路(圖5)包括Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、TNF信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)兩個重要炎性反應信號調控通路，其中靶點MAPK3、MAPK10、MAPK8等在通路中出現的次數較多。另外，MAPK3為馬針顆粒與豬腹瀉共有靶點，在馬針顆粒治療仔豬腹瀉靶點與機制研究中值得重點關注。

圖5 馬針顆粒靶點KEGG通路Fig 5 KEGG pathway of Ma Zhen Granule target

3 討 論

近些年，防控仔豬腹瀉的替抗產品研究主要集中在益生菌、有機酸、酶制劑、植物提取物、發酵飼料、中短鏈脂肪酸以及低蛋白質飼糧[9]。這些產品多以改善斷奶仔豬腸道健康為目的，具有提高生產性能、降低腹瀉率的作用，文獻顯示植物提取物降低腹瀉率優于其他替抗物質，更接近抗生素的防控腹瀉效果[10]，這可能與一些植物提取物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、增強免疫等多重功效有關[10-12]。中藥具有多成分多靶點，防控豬腹瀉同時還可改善脾胃功能、提高仔豬生長性能，是其他類型替抗產品無法替代的，在防控仔豬腹瀉特別是ETEC導致的斷奶仔豬腹瀉中應更具有前景性[13]。馬針顆粒是由馬齒莧和三顆針組成的中藥制劑，為我國三類新獸藥，在防治仔豬黃、白痢中具有顯著療效[1-3]，本研究基于網絡藥理學技術，通過虛擬篩選確定馬針顆粒的核心化合物與作用靶點，進一步探討了馬針顆粒核心化合物對仔豬腹瀉的調控機制。

馬針顆粒核心化合物異甜菜甙、異甜菜素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、槲皮素具有抗炎、抗菌、抗病毒與調節免疫系統作用，是馬針顆粒防治豬腹瀉性疾病的重要物質基礎。研究顯示，槲皮素具有廣泛的抗病毒抗菌作用，對流行性豬腹瀉病毒PEDV 3CLpro有抑制作用[14]，可提高腸道細胞Occludin和ZO-1 mRNA水平。飼料中添加槲皮素可改善肥育豬的豬肉品質以及提高抗病力肥育豬，還可促進畜禽飼料利用率，提高仔豬生長性能[14]。花生四烯酸在免疫細胞的磷脂中含量較高，代謝物PGE、PGI2和LTs為治療炎癥感染的重要因子，其代謝物中前列腺素D2和脂氧素B2濃度增高可進一步抑制炎癥反應[15-16]。β-胡蘿卜素能抑制炎癥因子IL-18、IL-6、TNF-α等信號傳導，在炎癥修復中發揮重要作用[17]。

通過化合物-靶點分析發現馬針顆粒關鍵靶點與炎癥等疾病相關，其重要靶點TP53、TNF、JUN、CASP3、MAPK14、MAPK3、MAPK1等與脂多糖引起的炎性反應過程、蛋白轉運、腺苷酸環化酶調控、細胞凋亡有關。TP53可通過調節細胞周期、凋亡、DNA修復和代謝變化相關基因的表達參與應激誘導反應[18]。TP53與結腸粘膜炎癥密切相關，TP53降低可導致凋亡前基因Casp3活性的增加[19]。CASP3是Caspase依賴途徑中凋亡的執行者[20]，與仔豬營養吸收與腸道損傷的發生有關。ETEC感染會導致仔豬空腸中CASP3激活與細胞凋亡顯著增加[21]，CASP3激活可抑制脂肪酸在腸內的吸收，其機制可能與CD36和FATP4基因有關[22]。TNF在機體自穩、防御反應中發揮重要作用，研究顯示粘膜炎癥水平與組織TNF水平呈正相關，TNF針對性治療手段常被用于治療炎癥性腸病[23]。MAPK1(ERK2)、MAPK3(ERK1)、MAPK14(p38MAPK)為MAPK信號通路重要成員，在胃腸道的發生發展、免疫性炎癥異常激活中起著至關重要的作用[24-26]。研究顯示，ERK1/ERK2和p38MAPK與IBD引起的腸粘膜損傷密切相關，ERK1/ERK2表達增加可以減少腸道炎癥和上皮細胞凋亡[27]。KEGG分析發現這些核心靶點主要富集于腫瘤壞死因子信號途徑(TNF signaling pathway)、Toll樣受體信號途徑(Toll like receptor signaling pathway)等炎性反應與免疫調控相關信號通路，說明馬針顆粒干預豬腹瀉過程可能與介導TNF、TLR信號通路調控炎性反應與免疫過程有關，作用CASP3靶點結果為馬針顆粒應用與研究提高豬生長性能提供基礎與方向，值得進一步研究確認。通過靶點定位得到馬針顆粒靶點主要分布在腸道與免疫系統中，這可能是馬針顆粒在防治仔豬腹瀉具有顯著療效的重要原因。

綜上所述，馬針顆粒防治仔豬腹瀉作用與異甜菜甙、異甜菜素、花生四烯酸、β-胡蘿卜素、槲皮素等化合物作用于TP53、TNF、JUN、CASP3、MAPK14、MAPK3、MAPK1等核心靶點，調控TNF、TLR等炎性反應通路抑制或減輕炎癥有關。