基于花粉微觀特征的木瓜品種孢粉學研究及親緣關系分析

周冰謙 ，楊國紅 ，盧 恒 ，宋祥云 ，劉 峰 ，2，耿巖玲 ，2，王 曉 ，2，劉 偉 ，2，李圣波

（1.齊魯工業(yè)大學/山東省科學院，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.齊魯工業(yè)大學/山東省科學院藥學院，山東 濟南 250014；3.山東亞特生態(tài)技術股份有限公司，山東 臨沂 276017）

中藥木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciose （Sweet） Nakai 的干燥近成熟果實［1］，其氣微清香，味酸，具有舒筋活絡、和胃化濕功效，主要用于治療濕痹拘攣、腰膝關節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉筋攣痛、腳氣水腫。 中國作為木瓜屬植物的起源中心，已有 3000 多年的栽培歷史［2］，木瓜原生種全世界共有 5 種，有 4 種原產于中國［3］，其中載入《中國藥典》的為皺皮木瓜（貼梗海棠），但臨床上仍有其余幾種混用的現(xiàn)象。 由于木瓜栽培具有分布廣、品種多等特點，其被引種到自然分布區(qū)以外時，為了適應新的生態(tài)地理環(huán)境條件，外觀形態(tài)會發(fā)生較大變化，因此出現(xiàn)木瓜同種間形狀多樣、鑒別困難等問題［4］。

花粉作為攜帶大量遺傳信息的雄性生殖細胞，受基因型控制，是植物系統(tǒng)發(fā)育過程中較保守的器官，不易受外部自然環(huán)境影響［5］，因此可作為探討植物起源進化、種屬鑒別及親緣關系鑒定的重要依據(jù)。本研究對采集的19 種木瓜花粉進行電鏡掃描觀察及系統(tǒng)聚類分析，以期為揭示木瓜的親緣關系和中間分類鑒別提供孢粉學資料，并為木瓜藥用植物新資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于孢粉學研究的19 種木瓜花均于2019 年4月10 日至11 日采自山東亞特藥用植物生態(tài)園木瓜種質資源庫，編號分別為YT001～YT004、YT012～YT013、YT018～YT021、YATS184～YATS185、YATS198～YATS199、YATS219、YATS336 及 YATS367～YATS369。原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為木瓜屬。

1.2 方法

將19 種木瓜的全開花剝取花藥置于薄層硫酸紙上，室溫下陰干，將花粉均勻彈撒后，用雙面導電膠固定在樣品托上進行噴金處理，利用掃描電子顯微鏡，觀察花粉性狀、對稱性、赤道面、極面觀特征、花粉形狀及外壁紋飾類型等特點，并隨機選取花粉20 粒，測量極軸長（P）、赤道軸長（E）、萌發(fā)溝長，計算P/E 值。 根據(jù)觀測結果，以供試的19 個品種作為分類運算單位進行系統(tǒng)聚類分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用 Screen Compass V4.0 軟件進行花粉 P、E的測量，Excel 軟件用于處理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0 軟件用于數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 不同種木瓜花粉顯微形態(tài)特征分析

對不同種木瓜的花粉進行電鏡掃描分析，結果表明發(fā)育良好的成熟木瓜花粉為單粒花粉，按照NPC分類系統(tǒng)［基于萌發(fā)器官的數(shù)目（N）、位置（P）和特征（C）的分類系統(tǒng)］進行對照，屬于N3P4C3型，外形為超長球形或長球形，赤道面觀為不規(guī)則長方形或橢圓形，極面觀為三裂圓形或三裂橢圓形。 萌發(fā)器官為沿極軸方向的3 條等間距分布的孔溝，在赤道面可觀察到2 條，在極面可以看到3 條，溝寬各異。見圖1。

圖1 木瓜花粉粒的顯微電鏡圖

對19 種木瓜花粉進行顯微形態(tài)特征觀察及描述，P 為 28.25～51.11 μm，E 為 16.49～26.58 μm，P/E 值 1.24～2.40，萌發(fā)溝長/極軸長為 0.62～0.97。 外壁紋飾類型條紋-腦紋狀紋飾或腦紋狀紋飾，穿孔的數(shù)目不同。 見表 1、表 2。

表1 19 種木瓜樣品的花粉形態(tài)特征

表2 19 種木瓜樣品的花粉微觀形態(tài)特征

2.2 木瓜花粉的聚類分析

對 19 種木瓜花粉的 P、E、P/E、萌發(fā)溝、萌發(fā)溝/極軸5 個定量指標及花粉形狀、赤道面特征、極面觀特征3 個定性指標進行聚類分析，得到譜系聚類圖，見表4、圖2。 在等級結合線L1 處 19 個品種被劃分為3 大組，其中第Ⅰ類組中4 個品種（YT002、YATS184、YATS219、YATS367）與另外 4 個品種（YA TS198、YT018、YT003、YT001）緊密聚類，說明其親緣關系近；第Ⅱ組包括 YT020、YT021、YATS185 及YATS336、YT012、YATS369、YT019，其中 YT020 與YT021 之間相似度更大，此結果與YATS336、YT012和YATS369 聚類結果相似，表明這3 種類型相似度最大，可能存在較近的親緣關系；第Ⅲ組分類包括YT004、YATS368、YATS199 與 YT0139 聚成一類，其中 YT004、YATS368 和 YATS199 這三個品種緊密聚類，說明這三者間的相似度很大。 第Ⅱ組與第Ⅲ組之后在遺傳距離15.0 處聚類，可知這兩組其相似性有限；其后在遺傳距離25.0 處與第Ⅰ組聚成一類，親緣關系較遠。

圖2 19 種木瓜樣品的花粉性狀聚類分析圖

表4 19 種木瓜樣品的花粉聚類分析指標

3 討論

花粉粒是種子植物雄蕊花粉囊內的粉狀體［6］，其形態(tài)特征受植物基因型控制而不受外界環(huán)境的影響，具有極強的遺傳保守性，其花粉大小、形狀、表面雕紋及花粉壁結構作為重要的孢粉學分析指標比其他性狀更穩(wěn)定［7］，因此可以為植物系統(tǒng)分類學提供依據(jù)，是探討植物起源、演化及親緣關系的重要特征之一［8］。 目前公認花粉是按照由大到小的順序進化，即相對原始的被子植物花粉體積相對較大，其花粉粒大小的范圍為 50～99 μm［9］，有學者認為花粉隨著植物由低等向高等的進化，形態(tài)由球形轉變?yōu)槌L球形［10］。 本研究中 19 種木瓜的花粉均屬于 N3P4C3型，與前人研究結果具有一致性［8］。 且其花粉為超長球形或長球形，具有3 個萌發(fā)孔溝及條紋狀的表面紋飾，在被子植物中屬于進化較成熟的種群。 雖然

木瓜屬各樣品花粉在外壁紋飾、萌發(fā)孔位置、形狀等方面的相似性表明其在屬的水平上具有統(tǒng)一性，但P、E、P/E 等差異性表明其在遺傳物質上存在不同，同屬植物種間花粉形態(tài)特征的區(qū)別可作為區(qū)分植物的依據(jù)，因此對花粉微觀結構的研究可為木瓜屬植物的分類與鑒定提供基礎數(shù)據(jù)。

在木瓜屬花粉性狀的聚類分析圖中，供試木瓜屬的19 個樣品被劃分為3 大類群，說明花粉性狀可作為分類輔助方法［10］，同時該結果也客觀反應出該屬不同種之間的親緣關系。 因此木瓜孢粉學親緣關系可反映不同品種的分類地位，對揭示其親緣關系有重要意義；此為山東藥用木瓜植物資源的開發(fā)提供了依據(jù)。