化瘀無糖顆粒HPLC 指紋圖譜研究

陳金娜，萬齊越，劉向紅

（山東大學齊魯醫院，山東 濟南 250012）

化瘀無糖顆粒是由山東大學齊魯醫院經驗方化瘀顆粒經工藝優化制成的無糖劑型［1］，由人參、蒲公英、土茯苓、漏蘆、水蛭、柴胡、蒼術、當歸、蒲黃等13味中藥組成。 方中人參苦甘而溫，大補元氣、生津養血，為君藥；蒲公英配伍土茯苓、漏蘆清熱解毒、消癰散結，共為臣藥；柴胡、郁金行氣活血，蒲黃、當歸補血活血止痛，水蛭破血消癥，牛膝逐瘀通經、引血下行，蒼術健脾安胃，熟地黃補血滋陰，以上共為佐藥；炙甘草補脾和胃，調和諸藥，為使藥。 諸藥合用共奏補益正氣、消腫散結之功效。 目前，化瘀無糖顆粒的質量控制方法為部分成分的定性定量檢測［2］，而中藥復方成分復雜，具有靶點多、整體協同等特點，單一組分或幾種成分的定性定量分析無法準確、全面反映中藥復方制劑的整體質量［3-4］。

中藥色譜指紋圖譜利用現代分析方法，以圖、表、數據的形式綜合、可量化地識別中藥中的復雜成分，具有整體性和模糊性的特點，能更全面地反映中藥化學成分的多樣性和中藥方劑功效的整體性，近幾十年來在中藥及其復方制劑質量控制中得到廣泛應用［5-8］。 課題組首次采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）建立化瘀無糖顆粒指紋圖譜，確定并指認共有峰，以期全面評價化瘀無糖顆粒制劑質量，為進一步研究其作用機制提供理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

分析天平（CP2250，奧豪斯國際貿易有限公司）、高效液相色譜儀（6CE，美國 Waters 公司）、Waters 2996 DAD 檢測器、Empower600 色譜工作站、KDM型控溫電熱套（V1000 mL，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）、876-Ⅰ型真空干燥箱（南通科學儀器廠）、超聲波清洗機（SK5200H）、旋轉蒸發器（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

次黃嘌呤（批號140661-200903）、咖啡酸（批號110885-200102）、香蒲新苷（批號 111573-200604）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（批號 111571-200604）、落新婦苷（批號 111798-201102）、人參皂苷 Rg1（批號110703-201027）、人參皂苷 Re（批號 110754-201123）、人參皂苷 Rb1（批號 110704-201122）、甘草酸銨（批號110731-201116）、柴胡皂苷 a（批號 110777-201108），均購自中國食品藥品檢定研究院。 化瘀無糖顆粒處方中13 味中藥飲片購自山東中醫藥大學附屬醫院，12 批次（S1～S12）化瘀無糖顆粒樣品由山東中醫藥大學附屬醫院制劑室制備。 乙腈、磷酸為色譜純，余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）（0～7 min，10%A；7～12 min，10%～15%A；12～18 min，15%A；18～23 min，15%～17%A；23～28 min，17%A；28～33 min，17%～18%A；33～38 min，18%A；38～43 min，18%～19%A；43～53 min，19%A；53～75 min，19%～29%A；75～80 min，29%A；80～100 min，29%～40%A；100～120 min，40%A）。 檢測波長 203 nm，流速1.0 mL/min，進樣量 10 μL，柱溫 25 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取次黃嘌呤1.77 mg、咖啡酸 2.03 mg、香蒲新苷 1.96 mg、異鼠李素-3-O-新橙皮苷1.86 mg、落新婦苷2.06 mg、人參皂苷Rg12.55 mg、人參皂苷Re 2.82 mg、人參皂苷Rb12.93 mg、甘草酸銨1.72 mg、柴胡皂苷a 2.12 mg。上述對照品共置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容，作為混合對照品溶液。 次黃嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新婦苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草酸銨、柴胡皂苷a 的質量濃度分別為 70.8 μg/mL、81.2 μg/mL、78.4 μg/mL、74.4 μg/mL、82.4 μg/mL、102.0 μg/mL、112.8 μg/mL、117.2 μg/mL、68.8 μg/mL、84.8 μg/mL。

2.2.2 化瘀無糖顆粒樣品溶液 精密稱取化瘀無糖顆粒2.0 g，加入甲醇30 mL，于50 ℃加熱回流30 min，濾過，精密量取續濾液15 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加入水飽和正丁醇萃取3 次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，加入純水洗滌3 次，每次30 mL，取正丁醇層蒸干，加入適量甲醇溶解，轉移至2 mL 容量瓶中，定容，0.22 μm 微孔濾膜濾過，作為化瘀無糖顆粒樣品溶液。

2.3 參照峰的選擇

考察化瘀無糖顆粒HPLC 指紋圖譜，所有色譜峰中10 號峰，即落新婦苷峰吸收強而穩定，峰面積大，分離效果良好，且落新婦苷是臣藥土茯苓的指標成分［9］，也是藥理活性成分［10-13］，因此選取 10 號峰為參照峰（S）。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取S1 樣品按照2.2.2 項下方法制備樣品溶液，以2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，以落新婦苷峰作為參照峰，計算各峰相對保留時間（tR）和相對峰面積。

2.4.2 穩定性試驗 取S1 樣品按照2.2.2 項下方法制備樣品溶液，按 2.1 項下色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h 依次進樣測定，計算各峰tR和相對峰面積。

2.4.3 重復性試驗 取S1 樣品按照2.2.2 項下方法制備樣品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各峰tR和相對峰面積。

2.5 指紋圖譜的建立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜建立與分析 取化瘀無糖顆粒樣品S1～S12 按照2.2.2 項下方法平行制備樣品溶液，按照2.1 項下色譜條件測定混合對照品溶液和樣品溶液，記錄色譜圖。

2.5.2 相似度評價 將所得指紋圖譜導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系件”（2004A版），以對照譜圖上標示的色譜峰作為匹配點，進行多點校正。

3 結果

3.1 方法學考察結果

精密度實驗中，色譜圖中各主要色譜峰tR的相對標準偏差（RSD）為0.04%～1.48%，相對峰面積RSD 為2.66%～4.82%，表明儀器精密度良好。 穩定性實驗中，色譜圖中各主要色譜峰tR的RSD 為0.03%～1.28%，相對峰面積的RSD 為2.30%～4.32%，表明樣品溶液24 h 內穩定。 重復性實驗中，色譜圖中各主要色譜峰tR的RSD 為0.04%～0.72%，相對峰面積的RSD 為3.28%～4.80%，表明該方法重復性良好。見表1。

表1 化瘀無糖顆粒指紋圖譜方法學考察結果（相對標準偏差）

（續）表1 化瘀無糖顆粒指紋圖譜方法學考察結果（相對標準偏差）

3.2 化瘀無糖顆粒指紋圖譜的建立

將12 批樣品色譜圖導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A 版），見圖1。12 批樣品中共標定21 個共有峰，其中10 個共有峰與對照品色譜圖中的保留時間一致，可指認1、4、6、9、10、13、14、17、20、21 號峰分別為次黃嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新婦苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草酸銨、柴胡皂苷a，見圖2。 其余11 個共有峰仍需進一步研究。 相似度評價結果顯示，12 批樣品指紋圖譜的相似度值依次為 0.974、0.981、0.981、0.981、0.952、0.973、0.983、0.981、0.977、0.938、0.940、0.969， 平 均值為 0.9692，RSD 值為 1.69%（n=12），內在成分整體化學譜峰信息表明12 批化瘀無糖顆粒樣品質量相對穩定。

圖1 12 批化瘀無糖顆粒高效液相色譜指紋圖譜疊加圖（A）和對照指紋圖譜（B）

圖2 混合對照品高效液相色譜色譜圖（A）及化瘀無糖顆粒高效液相色譜色譜圖（B）

4 討論

化瘀無糖顆粒為13 味藥組成的中藥復方制劑，其提取工藝為水煎煮提取法，成分復雜。 本實驗考察了樣品溶液制備方法，采集不同濃度的甲醇提取液進行HPLC 分析，存在雜質峰干擾嚴重、色譜峰分離效果較差等問題。 實驗過程中發現采用甲醇回流、水飽和正丁醇萃取、純水充分洗滌的方法可消除大部分干擾峰，實現較好的分離效果，且色譜峰信息較多，故選擇此方法。

本實驗考察了不同體積分數、不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水，乙腈-磷酸作為流動相時的色譜圖保留時間和分離效果，比較各流動相系統等度洗脫和梯度洗脫模式，最終選定乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫。 通過DAD 檢測器全波長（200～400 nm）掃描，可見203 nm 時檢出峰信息較多，各峰分離效果較好，峰高比例適宜，基線較平穩，故本研究選擇203 nm 為檢測波長。

研究建立了化瘀無糖顆粒HPLC-DAD 指紋圖譜檢測分析方法，12 批化瘀無糖顆粒特征圖譜有21個共有峰（相對保留時間RSD 均小于1%），指認特征峰 10 個，1、4、6、9、10、13、14、17、20、21 號峰分別對應的化學物質為次黃嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新婦苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草酸銨和柴胡皂苷a，其中10 號峰落新婦苷分離度好，最為穩定，選作參照峰。

首次建立的化瘀無糖顆粒HPLC-DAD 指紋圖譜，圖譜出峰數目、出峰強度及共有峰整體分離度等均表現良好，能夠較全面地反映樣品整體化學組分的信息特征。 化瘀無糖顆粒樣品HPLC 指紋圖譜的相似度計算結果顯示，12 批樣品相似度均大于0.938，使得制劑質量控制標準更為完善、合理，可用于該制劑質量的綜合評價，為化瘀無糖顆粒作用機制研究提供理論基礎，亦可為其他中藥復方制劑建立HPLCDAD 指紋圖譜分析方法提供參考。