胰腺癌組織富含亮氨酸重復序列蛋白55基因的表達和啟動子區甲基化狀態及其臨床意義

金晶 陳穎 陳燕 許金芳 于齊宏 龐亞南 滿曉華 吳洪玉 呂順莉

1海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200433；2海軍軍醫大學軍隊衛生統計學教研室，上海 200433

胰腺癌惡性程度高，5年生存率低，早期診斷困難，近年發病率呈上升趨勢。我國國家癌癥中心2017年統計數據顯示，胰腺癌在我國男性惡性腫瘤發病率為第7位，女性第11位，占惡性腫瘤相關死亡率的第6位[1]，因此早期診治顯得尤為重要。近年來，越來越多的研究證實DNA的異常甲基化在腫瘤的發生和發展過程中起重要作用，腫瘤細胞DNA總體甲基化水平低于正常細胞，但在某些特定區域如啟動子區CpG島處于高甲基化狀態，可誘導基因突變、基因缺失，抑制基因表達，使抑癌基因喪失功能[2-4]。本研究應用甲基化芯片雜交篩選出富含亮氨酸重復序列蛋白55(leucine rich repeat containing 55，LRRC55)基因，觀察其在胰腺癌中的甲基化狀態，分析其mRNA表達與臨床特征的關系，探討LRRC55基因參與胰腺癌發病的潛在機制，以期對胰腺癌早期診斷提供新靶標。

材料與方法

一、標本收集

收集2019年5月至2021年5月間海軍軍醫大學第一附屬醫院普外科37例行手術切除并經病理學證實的胰腺導管腺癌組織及其癌旁正常組織(距腫瘤2 cm之內)。隨機選取2例胰腺癌組織及癌旁組織行LRRC55基因甲基化檢測；記錄其余35例患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、是否有淋巴結轉移及血CEA、CA19-9水平等指標。另收集2例正常胰腺組織標本，2例健康成人外周血標本作為對照。標本置于液氮中保存。

二、細胞培養

人胰腺癌細胞株PaTu8988由德國Marburg Phillips大學分子生物學和分子病理學研究所Elsasser博士惠贈，人胰腺癌細胞株ASPC1購于中國科學院細胞庫。細胞株置含小牛血清的DMEM培養液中，于37℃、95%濕度、5% CO2培養箱中培養。

三、胰腺癌組織和胰腺癌細胞株LRRC55基因啟動子區CpG島甲基化檢測

采用亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測LRRC55基因啟動子區CpG島甲基化狀態。以酚氯仿法抽提2例胰腺癌組織及癌旁組織、2株胰腺癌細胞株及2例正常成人外周血白細胞DNA，紫外分光光度計(NanoDrop ND-1000，美國)測定DNA純度和濃度。DNA亞硫酸氫鹽修飾和回收純化按EZ-DNA Kit試劑盒(北京天漠科技開發有限公司)說明書操作，置于-20℃保存。引物設計參考Pubmed GenBank中報告的LRRC55基因(GeneID：219527)序列，應用methyl-primer express1.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成。LRRC55甲基化正向引物序列為5′-GTAGGAAAATAGGTAGCGTTAGGTC-3′，反向引物序列為5′-AAAAAAACCGAAAATAATACCACG-3′，擴增片段為130 bp；LRRC55-BSP正向引物序列為5′-GGTTTAGAAAAATGAGTTTG-3′，反向引物序列為5′-CCTTCATCCCAACATCCCTT-3′，擴增片段為256 bp；內參β-actin正向引物序列為5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′，反向引物序列為5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′。PCR反應條件：BSP退火溫度為53.3℃，甲基化退火溫度為61.3℃，菌落PCR退火溫度為60℃。PCR產物經含0.5 mg/L溴化乙錠的1.8%瓊脂糖膠進行鑒定，用復日FR-980生物電泳圖像分析系統攝影。

四、胰腺癌組織LRRC55基因mRNA表達檢測

采用實時定量PCR法檢測35例胰腺癌及癌旁組織、2例正常胰腺組織中LRRC55基因mRNA的表達。采用TRizol試劑(美國Invitrogen公司)提取組織總RNA，分光光度計測定總RNA純度和濃度。取1 μg總RNA在20 μl反應體系中一步法轉錄cDNA(美國Takara公司)。LRRC55引物和探針混合液購自Thermo Fisher公司。以GAPDH作為內參，正向引物序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物序列為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，由上海英駿生物有限公司合成。PCR反應條件：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。由儀器自帶軟件獲取Ct值，采用2-△△Ct公式計算LRRC55 mRNA相對表達量。

五、統計學處理

應用SPSS 24.0軟件進行數據分析。胰腺癌和癌旁胰腺組織間LRRC55基因mRNA表達量以M(Q1，Q3)表示，兩組間比較采用非參數配對秩和檢驗法。采用Spearman法或Wilcoxn符號秩檢驗分析LRRC55基因mRNA表達量與臨床特征間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、胰腺癌組織和胰腺癌細胞株LRRC55基因啟動子區CpG島甲基化水平

LRRC55基因啟動子區CpG島在2例胰腺癌組織和2株胰腺癌細胞株(PaTu8988、ASPC)中為高甲基化狀態，平均甲基化率為53%、71%；在2例癌旁組織、2例正常胰腺組織和2例健康成人外周血標本中為低甲基化狀態，平均甲基化率分別為8%、11%、9%(圖1)。

二、胰腺癌組織LRRC55基因 mRNA的表達

35例胰腺癌組織和對應癌旁正常胰腺組織LRRC55基因mRNA的相對表達量分別為0.21(0.02，1.00)、0.98(0.33，3.66)，胰腺癌組織mRNA表達量顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(P=0.003，圖2)。

圖1 LRRC55基因在各樣本中BSP克隆測序結果比較

三、LRRC55基因mRNA表達量與胰腺癌臨床特征之間的相關性分析

相關性分析結果顯示，胰腺癌組織LRRC55基因mRNA表達與腫瘤分化、CEA(r=-0.423，P=0.011)顯著相關，而與患者年齡、性別、腫瘤部位及大小、CA19-9水平、有無淋巴結轉移及臨床分期均無相關性(表1)。

討 論

腫瘤的發生發展是多因素、多基因參與的復雜過程，其中包括原癌基因及腫瘤抑制基因的改變、錯配修復基因的突變、DNA甲基化和微衛星不穩定性等。DNA甲基化是影響基因表達的重要機制之一，與腫瘤發生有著密切聯系，腫瘤中DNA甲基化主要為總體甲基化水平降低和特定區域高甲基化[3,5-7]。基因總體甲基化水平降低導致染色體不穩定、DNA修復基因、細胞周期調控基因、血管形成及細胞凋亡基因相應的CpG島的甲基化，促進腫瘤細胞的形成[8-10]。在腫瘤細胞中CpG島DNA甲基化是較為顯著的異常表觀遺傳改變，發生高甲基化的特定區域一般是跨越管家基因和腫瘤抑制基因啟動子的CpG島區，作為表觀遺傳調控因子能夠誘導基因編碼區突變或使基因失活而促進腫瘤的發展[11-13]。腫瘤早期即可表現為腫瘤抑制基因甲基化水平的升高，因此異常DNA甲基化認為可用來評估癌癥前期進展的潛在早期診斷生物標志物[11]。

表1 胰腺癌組織LRRC55基因mRNA表達量與臨床特征之間的關系

筆者前期應用甲基化芯片雜交篩選出LRRC55基因，該基因定位于11q12.1，有2個外顯子，是LRRCγ亞基家族的成員之一，可有效調節BK通道激活的電壓依賴性[14]。通道的激活可以同時受到膜電勢和胞內鈣離子濃度的調控，使鉀離子流出細胞外，細胞超極化，細胞興奮性降低，從而調節細胞多種生理功能。LRR結構域在BK通道γ亞單位的表達、細胞表面轉運和通道調節功能的調節中起關鍵作用[15]。有研究顯示LRRC55在成人大腦內側韁核、小腦和腦橋中表達升高，可能對神經元興奮性具有獨特的影響[16]。LRRC55在局灶性節段性腎小球硬化、糖尿病腎病和膜性腎病患者腎小球足細胞中表達增加，同樣在血管緊張素Ⅱ誘導足細胞損傷小鼠模型中足細胞表達升高，可能通過增加足細胞BK通道電流密度產生相應影響[17]。本研究結果表明LRRC55基因啟動子區CpG島在胰腺癌組織和細胞株中均呈高甲基化狀態，同時該基因mRNA在胰腺癌組織中呈低表達，并與腫瘤分化程度、血CEA水平明顯相關。DNA 甲基化是表觀遺傳最具有特征性的機制之一，可調控基因的特異性表達，抑癌基因、腫瘤轉移抑制基因、激素受體基因和DNA修復基因等啟動子區高甲基化可使其表達降低或不表達，而癌基因啟動子區低甲基化則使其表達升高，從而促進腫瘤的形成。這表明LRRC55基因啟動子區高甲基化，導致其mRNA在胰腺癌中低表達，從而造成腫瘤分化程度的不同。

綜上所述，LRRC55基因啟動子高甲基化狀態可能是胰腺癌發生、發展的早期事件，該基因可能是胰腺癌的潛在抑癌基因。LRRC55是否通過BK通道參與其中還需進一步深入研究，探討該基因在胰腺癌發生發展中的作用機制。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明金晶：研究操作、數據整理、論文撰寫；陳穎、陳燕、于齊宏、龐亞南：研究指導、數據整理；許金芳：數據整理、統計學分析；滿曉華、吳紅玉：研究操作；呂順莉：研究設計、研究指導、論文修改