當歸多糖抗運動疲勞作用及其機制研究

黃彩云，何吉福，宋春虹，王 楠，馬玉德

甘肅中醫藥大學體育健康學院，甘肅蘭州730000

運動性疲勞是最為常見的一種疲勞形式，又稱體力疲勞。通常是由于機體經大量體力勞動及大量運動后所導致的，伴隨著肌肉過度緊張，體內能量消耗過多等生理現象［1］。研究已證實，運動耐力下降是運動疲勞最為直接的表現，而負重游泳是常見的評估運動耐力的動物實驗，可體現運動后的疲勞狀態，因此游泳實驗成為衡量抗疲勞特征的重要指標［2］。關于運動疲勞的產生其主要作用機制可能與體內的血乳酸（lactic acid，LD）、肌糖原（muscle glycogen，MG）、肝糖原（liver glycogen，LG）、氮的代謝產物和ATP酶的含量有關。

當歸，為多年生傘形科草本植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，當歸氣血雙補，使機體的氣血各有所歸，故名當歸［3-4］。當歸的化學成分復雜，有效成分主要為多糖和揮發油等［5］，其中當歸多糖（Angelica sinensispolysaccharide，ASP）的重要藥用價值已被很好的證實，包括抗氧化、增強免疫、延緩衰老、降血脂、抗心肌缺血、抗炎鎮痛等［6］，特別是一些多糖還被作為一種新型的天然能源物質迅速補充人體糖類損耗，達到良好的抗疲勞效果［7-8］，也有研究發現許多植物多糖成分也具有改善運動性疲勞的作用［9］，如熟地黃多糖［10］、黑參多糖［11］、枸杞子多糖［12］等對小鼠有較好的抗疲勞作用?？梢妼ふ野踩⒂行叶靖弊饔眯〉目蛊谔烊凰幉囊讶怀蔀楫斍把芯康臒狳c之一［13］。ASP是天然植物的提取物，憑借獨特的優勢深受學者們的青睞，目前，關于ASP 的研究主要集中在降血脂、防感染、調免疫、抗腫瘤和提高抗氧化能力等藥理作用方面，關于其抗運動疲勞及其機制的研究較少。因此，本研究通過實驗研究觀察不同劑量ASP 的抗運動性疲勞作用，并初步探討其機制，旨在為ASP 的開發與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF 級健康雄性昆明種小鼠60只，2月齡，體質量（25±2）g，購于中國農業科學院蘭州獸醫研究所（實驗動物生產許可證號：甘SCXK2015-0001），飼養于甘肅中醫藥大學SPF 級動物實驗室（使用許可證號：SYXK（甘）2015-0005）。小鼠飼養環境：室內溫度（23±2）℃，相對濕度60%～80%，12 h 晝夜循環光照，期間自由飲水、進食。動物實驗嚴格遵循動物倫理原則，經甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（審批號：2019-213）。

1.2 主要藥品、試劑和儀器

當歸購于蘭州市黃河藥材市場，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室李成義教授鑒定為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。乳酸試劑盒（南京建成生物工程研究所，A019-2-2）、血尿素氮試劑盒（南京建成生物工程研究所，C013-1-1）、ATP 酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，A016-1），肝/肌糖原試劑盒（上海滬鼎生物科技有限公司，D-20743），其余均為常見化學藥品。超細勻漿機（上海弗魯克公司，F6/10-10G），臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司，TD6），酶標儀（日本Thermo公司，Benchmark Plus）。

1.3 實驗方法

1.3.1 ASP 溶液的制備 將1 kg 當歸洗凈，60 ℃干燥12 h，粉碎后過40 目篩，得到當歸干粉。稱取500 g 當歸干粉，用5 倍體積的95%乙醇滲漏浸提2次，待冷卻后過濾，濾渣在真空干燥箱干燥后備用。采用熱水浸提法提取多糖，將干燥后的濾渣加水煎煮2次、煎液合并抽濾、離心，取上清，即為ASP 粗提液。將所得多糖粗提液減壓濃縮成黏稠浸膏狀，加入95%乙醇使溶液的含醇量為70%，充分攪拌，4 ℃醇沉過夜，于4 000 r/min 離心20 min，棄上清，收集沉淀物，進行冷凍干燥，所得干燥物即為ASP，共21.4 g，得率為4.28%。將ASP 配制成質量濃度分別為2.78、5.56、11.12 mg/mL的多糖溶液。

1.3.2 動物分組及運動疲勞模型的建立 經適應性喂養和游泳適應性運動訓練后，保留50只大鼠進行正式實驗。按照隨機數字表法分為空白對照組、模型組、ASP 高劑量組、ASP 中劑量組、ASP 低劑量組，每組10 只。除空白對照組外，其余各組小鼠負荷體質量5%鉛絲于尾根部，放入（25.0±2.0）℃水溫的游泳箱（水深40 cm）中開始負重游泳，觀察小鼠每次力竭時的狀態，即當其頭部完全不露出水面10 s時撈出，將其腹部朝上放于臺面上，可見小鼠反應遲鈍、呼吸加快、雙下肢及尾部自然下垂且身體不能自行翻轉，立即擦拭且用吹風機烘干毛發；1 次/d，連續負重游泳至力竭15 d［14］，造模期間飲水正常，飲食減半。

1.3.3 干預方法 造模第6 天開始，ASP 高、中、低劑量組小鼠分別灌胃相應劑量的藥物。根據人與小鼠體表面積系數法折算給藥量［15］，得出小鼠當歸每日灌胃量為1.3 g/kg，當歸提取ASP 的得率為4.28%，所以ASP 每日灌胃量為55.64 mg/kg，為低劑量組。按低劑量∶中劑量∶高劑量＝1∶2∶4 的比例，計算得出中劑量灌胃量為111.28 mg/kg、高劑量灌胃量為222.56 mg/kg。對應低、中、高濃度的ASP 溶液（2.78、5.56、11.12 mg/mL），每10 g灌胃量為0.2 mL；空白對照組和模型組僅以等量生理鹽水灌胃，連續灌胃10 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 小鼠運動耐力評估 疲勞最直接的表現是運動耐力的下降，負重游泳時間是反映運動耐力的重要指標［16］。記錄最后1次小鼠負重游泳至力竭的時間，負重游泳時間越長，小鼠運動耐力越強。

1.4.2 血清肌糖原、肝糖原、血乳酸及血尿素氮含量檢測 模型組和不同劑量組進行最后1次負重游泳后，休息30 min，采用摘眼球方法取血。血液于室溫靜置2 h（或4 ℃過夜）后，離心（2 400 r/min），抽取血清備用。選取對應的試劑盒檢測血乳酸、肌糖原、肝糖原、血尿素氮含量。空白對照組不負重游泳進行以上操作采樣。

1.4.3 肝臟、腎臟及后肢肌肉中不同ATP 酶含量檢測 小鼠取完血后，迅速摘取肝臟、腎臟及后肢肌肉（腓腸肌），采用生理鹽水漂洗后，制備勻漿，離心（4 000 r/min）后，取上清液備用。選取對應的試劑盒檢測肝臟、腎臟及后肢肌肉中不同ATP 酶含量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。計量資料服從正態分布時以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用LSD-t法（方差齊）或Tamhane'sT2 檢驗（方差不齊）。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠負重游泳時間比較

與模型組比較，ASP中、高劑量組小鼠負重游泳時間均有所延長（P＜0.05）。分別與ASP 低劑量組和ASP 中劑量組比較，ASP 高劑量組小鼠的負重游泳時間均更長（P＜0.05）?？梢婋S著ASP 劑量的增加，小鼠負重游泳的時間越長，說明在一定劑量范圍內，小鼠的負重游泳時間與ASP 攝入量存在量效效應。見表1。

表1 5組小鼠負重游泳時間比較（）minTable 1 Comparison of weight-bearing swimming times of mice in five groups（）min

表1 5組小鼠負重游泳時間比較（）minTable 1 Comparison of weight-bearing swimming times of mice in five groups（）min

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與ASP低劑量組比較，2）P＜0.05；與ASP中劑量組比較，3）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1) P＜0.05;compared with the ASP low-dose group,2) P＜0.05;compared with the ASP medium-dose group,3)P＜0.05.

2.2 5組小鼠血清肌糖原和肝糖原含量比較

與空白對照組比較，模型組小鼠血清肌糖原和肝糖原含量均降低（P＜0.05）。與模型組比較，ASP中劑量組血清肝糖原含量升高（P＜0.05）；ASP 高劑量組血清肌糖原和肝糖原含量均升高（P＜0.05）。與ASP低劑量組比較，ASP中、高劑量組血清肌糖原和肝糖原含量均較高（P＜0.05）。與ASP 中劑量組比較，ASP高劑量組血清肌糖原含量較高（P＜0.05）。見表2。

表2 5組小鼠血清肌糖原和肝糖原含量比較（）ng/LTable 2 Comparison of muscle glycogen and liver glycogen contents of mice in five groups（）ng/L

表2 5組小鼠血清肌糖原和肝糖原含量比較（）ng/LTable 2 Comparison of muscle glycogen and liver glycogen contents of mice in five groups（）ng/L

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與ASP 低劑量組比較，3）P＜0.05；與ASP 中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1) P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the ASP low-dose group,3) P＜0.05;compared with the ASP medium-dose group,4)P＜0.05.

2.3 5組小鼠血清血乳酸和血尿素氮含量比較

與空白對照組比較，模型組小鼠血清血乳酸和尿素氮含量均升高（P＜0.05）。與模型組比較，ASP低劑量組小鼠血清血乳酸含量降低（P＜0.05）；ASP中、高劑量組血清血乳酸和血尿素氮含量均降低（P＜0.05）。與ASP 低、中劑量組比較，ASP 高劑量組血清血乳酸含量均較低（P＜0.05）。見表3。

表3 5組小鼠血清血乳酸和血尿素氮含量比較（）mmol/LTable 3 Comparison of serum blood lactate and blood urea nitrogen content of mice in five groups（）mmol/L

表3 5組小鼠血清血乳酸和血尿素氮含量比較（）mmol/LTable 3 Comparison of serum blood lactate and blood urea nitrogen content of mice in five groups（）mmol/L

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與ASP 低劑量組比較，3）P＜0.05；與ASP 中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1) P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05;compared with the ASP low-dose group,3) P＜0.05;compared with the ASP medium-dose group,4)P＜0.05.

2.4 5組小鼠肝臟不同ATP酶含量比較

與空白對照組比較，模型組小鼠肝臟中Na+-K+-ATP 和Ca2+-Mg2+-ATP 酶含量均降低（P＜0.05）。與模型組比較，ASP中劑量組小鼠肝臟中Ca2+-Mg2+-ATP 含量升高（P＜0.05），ASP 高劑量組小鼠肝臟中Na+-K+-ATP 和Ca2+-Mg2+-ATP 酶含量均升高（P＜0.05）。與ASP 低劑量組比較，ASP 中、高劑量組小鼠肝臟中Ca2+-Mg2+-ATP 酶含量均較高（P＜0.05）。與ASP 中劑量組比較，ASP 高劑量組小鼠肝臟中Ca2+-Mg2+-ATP酶含量較高（P＜0.05）。見表4。

表4 5組小鼠肝臟不同ATP酶含量比較（）U/mgprotTable 4 Comparison of different ATPase content in the liver of mice in five groups（）U/mgprot

表4 5組小鼠肝臟不同ATP酶含量比較（）U/mgprotTable 4 Comparison of different ATPase content in the liver of mice in five groups（）U/mgprot

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與ASP 低劑量組比較，3）P＜0.05；與ASP 中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1) P＜0.05;compared with the model group,2) P＜0.05;compared with the ASP low-dose group,3)P＜0.05;compared with the ASP medium-dose group,4)P＜0.05.

2.5 5組小鼠腎臟不同ATP酶含量比較

與空白對照組比較，模型組小鼠腎臟中Na+-K+-ATP 酶、Mg2+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶含量均降低（P＜0.05），Ca2+-ATP含量降低不明顯（P＞0.05）。與模型組比較，ASP 高劑量組小鼠腎臟中Na+-K+-ATP酶和Mg2+-ATP酶含量均升高（P＜0.05）。與ASP低劑量組比較，ASP 高劑量組小鼠腎臟中Na+-K+-ATP 酶含量較高（P＜0.05）。與ASP 中劑量組比較，ASP 高劑量組小鼠腎臟中Na+-K+-ATP 和Mg2+-ATP酶含量均較高（P＜0.05）。見表5。

表5 5組小鼠腎臟不同ATP酶含量的比較（）U/mgprotTable 5 Comparison of different ATPase contents in kidneys of mice in five groups（）U/mgprot

表5 5組小鼠腎臟不同ATP酶含量的比較（）U/mgprotTable 5 Comparison of different ATPase contents in kidneys of mice in five groups（）U/mgprot

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與ASP 低劑量組比較，3）P＜0.05；與ASP 中劑量組比較，4）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1) P＜0.05;compared with the model group,2) P＜0.05;compared with the ASP low-dose group,3)P＜0.05;compared with the ASP medium-dose group,4)P＜0.05.

2.6 5組小鼠后肢肌肉不同ATP酶含量比較

與空白對照組比較，模型組小鼠后肢肌肉中Na+-K+、Mg2+、Ca2+、Ca2+-Mg2+4 種ATP 酶含量均降低（P＜0.05）。與模型組比較，ASP 低劑量組小鼠后肢肌肉中Ca2+-Mg2+-ATP 酶含量升高（P＜0.05）；ASP中劑量組后肢肌肉中Mg2+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶含量均升高（P＜0.05）；ASP高劑量組小鼠后肢肌肉中Na+-K+、Mg2+、Ca2+、Ca2+-Mg2+4 種ATP酶含量均升高（P＜0.05）。與ASP低劑量組比較，ASP中劑量組小鼠后肢肌肉中Mg2+-ATP 酶含量較高（P＜0.05），ASP 高劑量組小鼠后肢肌肉中Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶含量均較高（P＜0.05）。見表6。

表6 5組小鼠后肢肌肉不同ATP酶含量比較（）U/mgprotTable 6 Comparison of different ATPase contents in hindlimb muscles of mice in five groups（）U/mgprot

表6 5組小鼠后肢肌肉不同ATP酶含量比較（）U/mgprotTable 6 Comparison of different ATPase contents in hindlimb muscles of mice in five groups（）U/mgprot

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與ASP低劑量組比較，3）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1) P＜0.05;compared with the model group,2) P＜0.05;compared with the ASP low-dose group,3)P＜0.05.

3 討論

3.1 ASP能夠延長負重小鼠游泳的時間

運動性疲勞是由運動引起的一種常見的生理現象，其疲勞程度可依據體內組織、器官的機能水平和運動能力來評定［17］。小鼠負重游泳是強迫性全身消耗性運動，負重游泳時間是衡量抗疲勞特性中最常見的指標之一［5］，延緩運動性疲勞的發生可體現為運動耐力的增強，負重游泳時間越長，則說明藥物的抗疲勞效果越好［18］。本實驗結果顯示，連續灌胃10 d 低、中、高3 個劑量的ASP 后，小鼠負重游泳時間分別延長了14.42%、28.10%和184.11%，表明ASP 可以提高負重游泳小鼠的運動耐力，延長運動力竭的時間，發揮抗運動疲勞作用，且存在一定的量效關系。這與LIU等［19］及阮治寰等［20］研究發現ASP 能夠提高小鼠的運動耐力，且其作用效果與ASP劑量有關的研究結論基本一致。

3.2 ASP 對負重游泳小鼠肌糖原和肝糖原含量的影響

糖原是機體劇烈運動時的能量來源，運動過程中先消耗肌糖原，繼而消耗肝糖原［21］，肌/肝糖原含量增多，機體耐力越好，運動時間則越長［22］，因此，其儲備量也可反映機體的疲勞程度［23］。本研究結果顯示：與空白對照組比較，模型組小鼠肌糖原和肝糖原含量顯著降低，說明負重游泳會迅速消耗小鼠的肌糖原和肝糖原。給予不同劑量ASP 后，與模型組比較，ASP 高劑量組肌糖原和肝糖原的含量顯著增加，提示ASP 可能通過提升糖原儲備或減少運動時機體糖原消耗，進而延緩疲勞的過早發生，顯示出ASP抗疲勞的功效。

3.3 ASP 對負重游泳小鼠血清血乳酸和血尿素氮的影響

生化指標檢測也是評價體力疲勞的主要方法之一［24］。人體在進行長時間運動時，所需能量優先由葡萄糖供能，當體內的葡萄糖消耗大于供應時，機體出現缺氧反應，此時能量則由有氧供能開始向無氧供能轉換。無氧供能過程中體內部分葡萄糖分解不徹底，從而產生大量乳酸，當乳酸含量驟增時，血乳酸濃度也相應升高，導致肌肉中H＋濃度升高，pH值下降，進而導致機體能量代謝能力下降，產生疲勞，進一步引起機體運動能力降低［25］。因此，機體疲勞產生和消除速度的重要指標可用血乳酸水平來評定［26］。尿素氮與機體運動耐力、身體機能和疲勞密切相關，是在能量供給不充足情況下產生的代謝物，負荷越大則產生的尿素氮越多［27］，其含量也可反映疲勞的程度［28］。本實驗結果顯示：與空白對照組相比，模型組小鼠血清血乳酸和血尿素氮顯著升高；與模型組比較，ASP低劑量組顯著降低了負重游泳小鼠運動后血乳酸含量，ASP中、高劑量組均顯著降低了小鼠運動后血清血乳酸和血尿素氮含量。結果表明，ASP達到一定劑量后，可能通過降低負重游泳小鼠血清血乳酸和血尿素氮含量，發揮其抗疲勞功效。

3.4 ASP 對負重游泳小鼠肝臟、腎臟和后肢肌肉ATP酶含量的影響

生物體內能量直接供給的唯一來源是ATP［29］，其酶活性可反映機體能量代謝的水平，其中Na＋-K＋-ATP 酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP 是細胞膜上特殊的蛋白質，對于維持細胞內外離子平衡至關重要，可分別驅動Na＋/K＋和Ca2＋/Mg2＋于細胞膜兩側進行雙向運輸，從而維持細胞膜電位，進而催化ATP 分解供能［30］。本實驗結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠負重運動后肝臟中Na＋-K＋-ATP 和Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶含 量降低，腎臟中Na＋-K＋-ATP 酶、Mg2＋-ATP 酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶含量降低，后肢肌肉中的Na＋-K＋、Mg2＋、Ca2＋、Ca2＋-Mg2＋4 種ATP酶含量均降低。表明機體能量代謝發生異常，這可能是導致機體最終出現疲勞的直接原因［31］。與模型組比較，ASP 低劑量組小鼠后肢肌肉中Ca2＋-Mg2＋-ATP酶含量升高；ASP中劑量組小鼠肝臟中的Ca2＋-Mg2＋-ATP 含量升高，后肢肌肉Mg2＋-ATP 酶、Ca2＋-ATP 酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶含量升高；ASP 高劑量組小鼠肝臟中的Na＋-K＋-ATP 和Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶含量升高，腎臟中Na＋-K＋-ATP 酶和Mg2＋-ATP 酶含量升高，后肢肌肉中Na＋-K＋、Mg2＋、Ca2＋、Ca2＋-Mg2＋4種ATP 酶含量均升高；其中以ASP 高劑量組升高最明顯。提示ASP 抗疲勞作用可能與其能調節機體ATP 酶含量、改善機體能量代謝水平有關。

4 小 結

本研究探討了不同劑量ASP 與抗運動疲勞作用的關系及其機制，結果表明，ASP在一定范圍內可顯著延長小鼠負重游泳時間，發揮抗疲勞功效，其作用機制與ASP 可顯著提高小鼠運動耐力、提升糖原儲備、減少乳酸與尿素氮堆積、改善機體能量代謝水平有關。