微波處理時間對大豆高溫脫脂豆粕品質的影響

時玉強，萬華松，馬 軍，李 敏，郭增旺，蔡中勝

（1.山東禹王生態食業有限公司，山東禹城 251200；

2.克東禹王大豆蛋白食品有限公司，黑龍江克東 164800；3.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150006）

近年來以植物蛋白質粉為主體的特醫類保健食品發展迅速。大豆蛋白以其優質的氨基酸組成，蛋白質消化率校正的氨基酸分數（PDCAAS）達到最大值1的人體消化利用率，成為最主要的植物蛋白質原料。1999年12月，美國食品藥品監督管理局（FDA）提出“每日攝入25 g大豆蛋白，可減少心臟病發生的風險”。除此之外，大豆蛋白被認為具有預防癌癥、預防骨質疏松、降低膽固醇、預防高血壓、減肥等功效。高溫脫脂豆粕加工的大豆蛋白粉具有不含抗營養因子，大豆熟豆香味濃郁，不產生工業廢水，不產生工業廢渣的生產優勢，同時該大豆蛋白粉不含油脂，含有豐富的大豆膳食纖維，大豆低聚糖以及大豆異黃酮等保健功能成分適合各類人群食用，特別適用于需要改善腸道功能，減肥等需求的人群。因此利用高溫脫脂豆粕生產可食用大豆蛋白粉具有巨大的市場前景和價值。

目前生產的高溫脫脂豆粕的含水量一般較高，約12%左右，同時存在抗營養因子和微生物不易控制的難題。微波處理能夠實現物料的內部加熱，干燥速率快。同時微波能夠起到殺菌的作用，作用原理主要為熱效應和非熱生物效應，與傳統的熱力殺菌相比，微波殺菌具有加熱時間短、升溫速度快、殺菌均勻、穿透力強、節約能源、加熱效率高、適用范圍廣等特點。微波效應能夠促進蛋白質的熱變性及生化反應，從而改善與蛋白成分相關的抗營養因子的活性，改善可食用性。目前微波廣泛應用于各類食品的干燥和殺菌中，并且在果蔬滅酶中的應用也逐漸受到學者的重視。通過微波處理可一站式實現高溫脫脂豆粕的快速干燥、滅菌、滅酶，提高產品的品質，但目前未有相關報道。

本文將對高溫脫脂豆粕進行微波處理時間研究，分析微波時間對高溫脫脂豆粕的含水量、微波后溫度、菌落總數、脲酶活性、溶水后的顏色、大豆蛋白二級結構的影響，進而指導大豆蛋白粉專用的高溫脫脂豆粕的生產及應用。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

高溫脫脂豆粕 其中粗蛋白51.3%，粗脂肪1.2%，膳食纖維14.2%，克東禹王大豆蛋白食品有限公司；濃硫酸 分析純，煙臺遠東精細化工有限公司；氫氧化鈉 分析純，北京益利精細化學品有限公司；硫酸銅、丙酮 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醚 分析純，格里斯（天津）醫藥化學技術有限公司；95%乙醇 天津市津東天正化學試劑廠；重鉻酸鉀 分析純，茂名市雄大化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷 分析純，河南比愛歐生物科技有限公司；2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸 分析純，翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

AL204-2C電子天平 梅特勒-托利多有限公司；LW-20 HMW微波設備 山東立威微波設備有限公司；LHS-150-A恒溫培養箱、HWS-26恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；Vortex 1旋渦振蕩器 廣州儀科實驗室技術有限公司；機器視覺色彩分析系統：Panasonic WV-CP470 攝像頭 松下電器（中國）有限公司；Grablink Full XR圖像采集卡Euresys有限公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）系統 美國尼高力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波處理方式及條件 微波處理設備示意圖如圖1，該設備配置有紅外溫度測定儀，可實時測定最后的物料溫度，通過實時記錄計算平均值，同時可控制傳輸速度。使用聚四氟乙烯微波物料盒長×寬×高=400 mm×400 mm×50 mm，高溫脫脂豆粕物料量厚度 20 mm，質量（1600±0.5）g。傳送帶寬度1000 mm，微波場長度6000 mm，物料盒放置于傳送帶中心位置，微波功率20 kW，風速2.5 m/s。傳送帶控制傳送速度，根據傳送速度調整處理時間分別為4.29、4.62、5.00、5.45、6.00 min。處理后密封冷卻至室溫，測量樣品為物料盒中心9個點取樣，如圖2所示。

圖1 微波處理設備示意圖Fig.1 Schematic diagram of microwave processing equipment

圖2 取樣點位置Fig.2 Sample collection point

1.2.2 含水量及干燥速率的測定 高溫脫脂豆粕的含水量的測定參考GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》的方法進行。在大氣壓下（101.3 kPa），將處理的高溫脫脂豆粕放入105 ℃的恒溫干燥箱內，干燥至試樣質量不再發生變化時結束干燥。每次結果取3個平行實驗的平均值。

干燥速率計算公式為：

式中，w為初始含水量（%）；w為干燥后的含水量（%）；t為干燥時間（min）； v為干燥速率（%/min）。

1.2.3 菌落總數的測定 高溫脫脂豆粕菌落總數的測定參考《GB 4789.2-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗-菌落總數測定》的方法進行。通過考察菌落總數減少量（初始菌落總數與微波處理后的菌落總數的差值）驗證微波處理的殺菌效果。

1.2.4 溶水后的顏色的測定 大豆蛋白粉專用的高溫脫脂豆粕最終產品水溶后的顏色直接影響產品的感官可接受程度。微波處理高溫脫脂豆粕的過程可發生羰氨反應產生誘人色澤，但處理過度會產生褐色物質，因此考察不同微波時間對其水溶液的顏色影響是評價微波效應的重要因素之一。取高溫脫脂豆粕使用萬能粉碎機粉碎，過 100目篩，取（10±0.1）g放入250 mL燒杯中，加25 ℃純水200 mL，放入磁力攪拌器中600 r/min攪拌10 min，倒入直徑30 mm的燒杯中，使用機器視覺色彩分析系統檢測色值。

1.2.5 脲酶活性的測定 高溫脫脂豆粕脲酶活性的測定參考GB 5413.31-2013《嬰幼兒食品和乳品中脲酶的測定》方法，使用機器視覺色彩分析系統檢測色值。

1.2.6 傅里葉紅外光譜（FTIR）測定蛋白質二級結構

FTIR的測定參照齊寶坤等的方法。將1 mg大豆高溫脫脂豆粕樣品與100 mg溴化鉀研磨均勻后壓片，置于紅外光譜儀中測定。波數掃描范圍500～4000 cm，掃描次數 64次，波數精度 0.01 cm，分辨率4 cm，測定溫度25 ℃。利用PeakfitVersion 4.12軟件譜圖擬合處理，根據其峰面積計算蛋白質各二級結構含量。

1.3 數據處理

所有的實驗至少進行3次實驗，利用SPSS16.0軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，＜0.05為顯著性差異。采用Origin 2020、PeakFit 4.12等軟件分析進行數據分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同微波處理時間對樣品溫度的影響

通過對原始含水量為11.1%的高溫脫脂豆粕進行微波處理，得到的不同微波時間下樣品的溫度變化如圖3。

圖3 不同微波時間的溫度變化Fig.3 Changes of temperature in different microwave treatment time

由圖3可以看出隨著微波時間的延長，高溫脫脂豆粕的結束溫度呈增加趨勢，微波結束溫度與微波時間呈線性關系：y=14.635x+22.985。該關系式的2達到了0.9879，擬合可信度極高。6 min時溫度達到110 ℃。

微波溫度是微波效應的直接體現，因物料狀態的不均勻性，造成含水量的不均衡性，吸收微波能的能力不同，造成了微波處理后物料溫度的不均衡性，微波溫度過高會增加局部物料過熱的概率，高溫脫脂豆粕富含大豆蛋白和碳水化合物，過高的溫度可以促進羰氨反應的進行繼而產生紅色到深褐色的物質，同時發生各種風味變化，是權衡大豆蛋白粉專用高溫脫脂豆粕溶水后的顏色與風味的關鍵控制參數。通過對產品分析發現在溫度控制在100～110 ℃時綜合評價最好，因此建議生產時微波溫度控制在 100～110 ℃。

2.2 不同微波處理時間對干燥速率的影響

通過對原始含水量為11.1%的高溫脫脂豆粕進行微波處理，得到的不同微波時間的含水量的關系如圖4。

圖4 不同微波時間的含水量變化Fig.4 Changes of moisture in different microwave treatment time

由圖4可以看出隨著時間的延長含水量呈下降趨勢。含水量與微波時間呈線性關系：y=-1.5102x+14.842，說明原始含水量11.1%的高溫脫脂豆粕在微波4～6 min時間內干燥速率呈恒速干燥階段，干燥速率為1.51%/min，該關系式的達到了0.9815，擬合可信度極高。在微波功率20 kW，料層厚度20 mm，風速2.5 m/s的條件下，微波6 min含水量達到5.88%，根據產品微生物控制需要，市場一般要求高溫脫脂豆粕控制在7%以下，根據擬合關系，此時的微波時間為5.19 min。

高溫脫脂豆粕的含水量決定了大豆蛋白粉含水量，將高溫脫脂豆粕的含水量控制在7%以下是生產大豆蛋白粉的關鍵工藝參數。微波功率、料層厚度、微波時間決定了微波的干燥速率，通過前期的微波處理能力及均勻性的實驗確定了微波的功率和料層厚度，微波時間相較于微波功率和料層厚度的可操作性及影響更大，因此在微波功率、料層厚度一定的情況下，研究微波時間對干燥速率的影響對高溫脫脂豆粕工業化生產具有指導意義。

2.3 不同處理時間對菌落總數的影響

通過對原始含水量為11.1%的高溫脫脂豆粕進行微波處理，得到的不同微波時間的菌落總數減少量的關系如圖5。

圖5 不同微波時間的菌落總數減少量變化Fig.5 Changes of total bacterial count reduction in different microwave treatment time

微波殺菌效果受熱效應和生物學效應的綜合影響，Zeng等認為高強度微波會導致酵母細胞死亡，主要是由于微波可造成不可逆的電解質、Ca和DNA的滲出。孫震等認為微波致金黃色葡萄球菌死亡的原因主要是改變了細胞膜的通透性。由圖5可以看出隨著時間的延長菌落總數減少量呈增加趨勢。原始菌落總數為3100 CFU/g的樣品，經過4.29 min微波處理后菌落總數減少量為2550 CFU/g，菌落總數減少到550 CFU/g；隨著微波時間的延長菌落總數下降的速度逐漸降低，在4.29～4.62 min區間內微波殺菌效果較好，5.45 min后不再變化。分析認為，5.45～6.0 min區間不再變化的原因為在微波處理后期微波的非熱生物學效應幾乎完成，熱效應占主導地位，物料本身微生物基數不斷下降，熱效應也逐漸衰弱。限于對物料整體風味及顏色的影響，微波處理時間沒有再延長。微波5.45 min時，基于菌落總數的評價，微生物的殺滅率達到96.8%，菌落總數達到100 CFU/g，完全符合各類食品，保健品甚至口服藥用的要求。

2.4 不同微波處理時間的水溶液顏色變化

大豆蛋白粉專用的高溫脫脂豆粕最終產品水溶后的顏色直接影響產品的感官可接受程度。微波處理的高溫脫脂豆粕不可避免的存在羰氨反應過程，因此考察不同微波時間對其水溶液的顏色影響是評價微波效應的重要因素之一，對工業化生產具有切實的指導意義，不同微波處理時間的高溫脫脂豆粕水溶液顏色變化見表1。

表1 微波處理時間對高溫脫脂豆粕水溶液顏色的影響Table 1 The effect of microwave treatment time on the color of the aqueous solution of high-temperature defatted soybean meal

微波處理前后及過程中高溫脫脂豆粕水溶液的值總體呈降低的趨勢，但是幅度較小，視覺感官上表現為顏色變暗，微波6 min時較明顯。從值上看，未微波的樣品水溶液紅色值最低，隨著微波時間的延長，水溶液顏色逐漸變紅，4.62 min時出現一個平臺期，直到5.45 min時紅色基本不變，維持到9左右，6 min時變紅較明顯。從值上看，黃色值呈逐漸增加的趨勢，特別是從5.45 min到6 min區間，變黃趨勢明顯增加。分析原因主要是微波處理后溫度不斷升高，溫度越高羰氨反應速度越快，在5.45 min時結果最好，超過6 min后顏色變暗，甚至發黑，存在著火的風險未再持續試驗，因此在生產中溫度控制到5.45 min為宜。

2.5 不同處理時間的脲酶活性的變化

大豆中含有脲酶和胰蛋白酶抑制劑，在加工用于生產大豆蛋白粉的高溫豆粕過程中需要對兩種物質進行滅活。脲酶和胰蛋白酶抑制劑的失活程度與熱作用呈正相關，因此檢測高溫脫脂豆粕的脲酶活性既能檢測脲酶的含量，又能反映胰蛋白酶抑制劑的活性，是一種經濟高效的檢測大豆抗營養因子的方法。通過對原始水分為11.1%的高溫脫脂豆粕進行微波處理后，按照國標GB 5413.31-2013的方法檢測，得到的不同微波時間脲酶檢測結果的顏色變化，通過機器視覺系統進行,,顏色空間分析結果如表2。

表2 脲酶活性顏色 L，a，b 值Table 2 L, a, b value for urease activity

脲酶活性檢測結果如圖6，未經微波處理的高溫脫脂豆粕樣品為次強陽性（橘紅色），經微波處理4.29 min的樣品為陽性（深金黃色），4.62 min的為弱陽性（淡黃色），經微波處理時間＞5 min的樣品為陰性（同色或低于對照樣）。

圖6 微波處理時間對高溫脫脂豆粕的脲酶活性檢測顏色的影響Fig.6 The effect of microwave treatment time on color for urease activity detection of high-temperature defatted soybean meal

通過微波處理能夠有效的抑制高溫脫脂豆粕的脲酶活性，這與部分學者對多種植物來源的物料中的多酚氧化酶的研究結果一致。

通過，，顏色模式分析發現，微波處理后的樣品值均在67左右，而次強陽性的未處理樣品明顯偏低，低約19%左右，值表示顏色的亮度，值越高說明顏色越亮，次強陽性的高溫豆粕值與陽性至陰性的樣品相比差異顯著（＜0.05），可考慮作為區分次強陽性和陽性的特征參數參考；微波處理后的樣品值相差不大，都在-2.2至0.4之間，但是未經微波處理的樣品值達到15.6，值是正值表示顏色為紅色，且值越高紅色越重，紅色值高代表脲酶活性高，按照GB 5413.31-2013的判定標準紅色值是次強陽性的重要標志；在紅色值上能夠有效地區分次強陽性和陽性；微波處理后的樣品值差異明顯，除未微波處理的次強陽性外，微波處理的值越高，黃色值越高，越接近陽性，值≤45時表現為弱陽性，隨著微波時間的延長超過5 min后黃色值與空白對照相當，次強陽性的值略低于陽性的樣品，可能是因為紅色值太高造成的黃色值檢測受到影響。

2.6 蛋白的二級結構分析

FTIR能夠提供高溫豆粕中大豆蛋白質分子的酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺III帶、蛋白質環狀結構中的C-C振動和C-O-O糖苷鍵振動的波段信息，結果如圖7所示。其中酰胺I帶（1600～1700 cm）的吸光度與蛋白質的二級結構之間存在一定的對應關系。通過對FTIR譜圖分析依次進行分段、基線校正、去卷積處理、二階導數擬合處理，經多次擬合后可獲得酰胺I帶的圖譜，不同微波時間處理的高溫豆粕的FTIR譜圖如圖7所示，通過計算各子峰積分面積得到二級結構4種類型的相對含量。各子峰與二級結構的對應關系為：1610～1640 cm為-折疊，1640～1650 cm為無規卷曲，1650～1660 cm為-螺旋，1661～1700 cm為-轉角。

圖7 不同微波處理時間的高溫豆粕FTIR圖Fig.7 Infrared spectra of high-temperature defatted soybean meal at different microwave treatment time

蛋白質紅外光譜的峰位遷移和鍵吸收的能量有關，從圖8可以看出相對于未處理原樣（圖8（a）），微波處理 4.29～6.00 min過程中（圖8b～f），其1622 cm位置峰遷移了+7～+14 cm說明蛋白質分子展開，折疊結構減小，位移趨勢是先增加后減小；1659 cm位置峰遷移了-1～+9 cm，表明蛋白質螺旋結構先減少后增加，且在微波處理4.29～5.45 min時（圖8b～e）該峰值位置跨過螺旋峰值位置；1675 cm位置峰遷移了+10～+19 cm，整體趨勢先增加后減少，表明蛋白質轉角結構先增加后減少。這些結果說明微波處理能夠使得蛋白質有序結構向無序結構的轉變。

不同微波處理的高溫豆粕中大豆蛋白質二級結構的相對含量如圖9所示。其中-折疊相對含量變化較小，微波處理后-折疊與未處理的相比下降4.2個百分點，隨著微波處理時間的增加，折疊先增加后降低，在5 min時（圖8d）達到最大值51.69%，在6 min時（圖8f）達到最低值44.78%；螺旋在微波處理4.29 min（圖8b）時消失；在5.45 min至6 min之間時（圖8e～f）出現并迅速增加，在6 min時（圖8f）達到49.63%；轉角經微波處理后迅速增加，在4.29 min時由未處理的19.3%增加到51.72%（圖8b），到5.45 min（圖8e）之前變化不大，但是在6 min時（圖8f）迅速降低至5.59%。可見微波處理的效率高，對蛋白二級結構的影響迅速。分析認為微波處理初期螺旋迅速向轉角轉化，進而消失，轉角量快速增加，結合酰胺I帶變化，各二級結構的峰值移動與上述變化一致，而折疊變化幅度較小，相對穩定，分析原因可能為通過微波處理大豆蛋白吸收微波能后，鍵能增加，同時產生熱效應，引起蛋白分子的二級結構發生變化。微波后期，特別是在5.45至6 min之間（圖8e～f）結構變化較快，轉角迅速向螺旋轉化，表現在顏色上迅速褐變，豆香味明顯增加，分析原因可能為隨著微波處理時間的增加發生羰氨反應，發生醇醛、醛胺縮合與氨基酸共價交聯導致二級結構構象發生變化。與大豆分離蛋白、大豆11S等蛋白明顯不同，高溫豆粕沒有無規則卷曲的吸光度，分析認為高溫豆粕加工過程中是在低溫環境下利用有機溶劑脫除油脂后干燥制得，蛋白分子受到細胞結構的保護因此沒有產生無規則卷曲。白明昧等研究認為-折疊含量與蛋白質溶解度和體外消化率呈極顯著負相關，-螺旋的含量與蛋白質體外消化率呈正相關。因此微波處理，特別在試驗條件下處理5.45 min的產品，能夠改善高溫豆粕的消化率，提高產品的品質。

圖8 不同微波處理時間的高溫豆粕的酰胺I帶變化Fig.8 Changes of amide I band of high-temperature defatted soybean meal subjected to different microwave treatment time

圖9 不同微波處理時間的高溫豆粕中蛋白質二級結構的相對含量Fig.9 Relative content of protein secondary structure of hightemperature soybean meal at different microwave treatment time

3 結論

通過研究不同的微波處理時間對大豆高溫脫脂豆粕影響發現，利用微波處理能夠快速有效地降低高溫脫脂豆粕的含水量，可提高高溫脫脂豆粕干燥效率，節約干燥時間，提高生產產能。通過微波處理可以有效地降低大豆高溫脫脂豆粕的菌落總數，因此微波處理，特別在試驗條件下處理5.45 min的產品，能夠改善高溫豆粕的消化率，提高產品的品質。微波處理后蛋白的二級結構出現較明顯的峰移，沒有產生無規則卷曲，折疊相對變化較小，而轉角和螺旋的相互轉化明顯，這與大豆分離蛋白的二級結構存在較大的差異，由此帶來的營養及保健價值有待進一步研究驗證。微波處理高溫脫脂豆粕無論是在含水量控制，微生物控制、外觀，還是抗營養因子控制方面均有較大的工業化應用前景。