文王濃香型白酒不同深度新老窖泥理化性質(zhì)與微生物演替分析

徐相輝，常 強，孫 偉，許姍姍，許博陽，穆冬冬，吳學(xué)鳳，李興江,

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601；

2.安徽文王釀酒股份有限公司，安徽臨泉 236400）

白酒根據(jù)風(fēng)味特點的不同可分為12種香型，其中濃香型白酒的產(chǎn)量占酒類行業(yè)的70%以上，是中國主要的白酒消費品。濃香型白酒采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵工藝，以高粱、小麥、玉米、糯米和大米為原料，稻殼為疏松劑，以中溫大曲為發(fā)酵劑在泥窖中發(fā)酵60～90 d后蒸餾制得。酒窖底部和側(cè)面均覆蓋有窖泥，獨特的泥窖發(fā)酵工藝賦予了濃香型白酒窖香濃郁，綿甜爽凈的特點。大量研究表明，窖泥的穩(wěn)定和成熟度與濃香型白酒的品質(zhì)和特征緊密相關(guān)，實際生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)“老窖產(chǎn)好酒”。窖泥的成熟是一個長期馴化的過程，新窖泥到成熟穩(wěn)定狀態(tài)的老窖泥要經(jīng)歷初馴期、過渡期和成熟期三個階段，需要較長的時間才能完成成熟轉(zhuǎn)換。

濃香型白酒的發(fā)酵過程涉及大曲、環(huán)境和窖泥多種微生物，也是微生物群落的演替以及各種微生物共生、共酵的過程。通過對糟醅微生物進行溯源分析發(fā)現(xiàn)，糟醅中的原核微生物主要來自窖泥。窖泥被認為是原核微生物的持續(xù)釋放源，同時糟醅中的原核微生物在窖泥成熟和穩(wěn)定中也扮演了重要角色。鄭佳等研究發(fā)現(xiàn)，靠近窖泥的糟醅蒸餾得到的原酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量更加豐富，窖池邊緣的糟醅中己酸、丁酸以及它們對應(yīng)的己酸乙酯、丁酸乙酯含量也高于同期窖池中間的糟醅。乳酸菌、芽孢桿菌等原核微生物產(chǎn)生己酸、丁酸、乙酸和乳酸等各種有機酸，作為酯類化合物的底物，參與了糟醅中風(fēng)味化合物的形成。

相比于池壁，池底窖泥所處環(huán)境氧氣更少，并長期浸泡在酸性的黃水中，窖泥微生物所處環(huán)境更為惡劣，因此對于窖泥理化與微生物的關(guān)聯(lián)分析有助于進一步指導(dǎo)新老窖泥的養(yǎng)護。同時，窖泥的成熟是一個連續(xù)動態(tài)的過程，伴隨著各類微生物的此消彼長。當(dāng)前，連續(xù)的發(fā)酵以及不合理的養(yǎng)護容易造成窖泥板結(jié)和窖泥微生物衰亡，最終導(dǎo)致窖泥退化，生產(chǎn)出的白酒品質(zhì)不佳。目前已有關(guān)于大曲和糟醅群落演替的研究，也有對新窖泥前四輪次發(fā)酵的窖泥微生物演替分析，而對于窖池垂直維度的微生物群落結(jié)構(gòu)的解析和演替鮮有報道。本研究通過對安徽文王貢酒新老窖池不同深度的窖泥細菌微生物進行分析，理清窖泥深度與其理化性質(zhì)、有機酸含量和窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)關(guān)系，為窖泥的穩(wěn)定成熟及窖池的養(yǎng)護提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用窖泥樣品來自正常生產(chǎn)的安徽文王釀酒股份有限公司3年（new）和30年（old）窖池，采樣點經(jīng)緯度 33°04′N；115°15 ′E，采樣時間為 2020年12月。取樣示意圖如圖1所示，從池底3個位置取樣混合在一起進行分析，每個采樣點分為0～2、2～4、4～6、6～8、8～10 cm 5 層，新窖泥標(biāo)注為 new_02～new_810；老窖泥標(biāo)注為 old_02～old_810。將采集樣品于均質(zhì)袋中充分混勻后置于4 ℃和-80 ℃冰箱，分別用于理化測定和高通量測序分析。

圖1 窖泥樣品取樣位置示意圖Fig.1 Schematic diagram of sampling location of pit mud samples

氟化銨、鹽酸、磷酸二氫鉀、氯化銨、重鉻酸鉀、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、抗壞血酸（均為分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；納氏試劑 上海源葉生物有限公司；氯化亞錫、鉬酸銨 上海麥克林生化科技有限公司；2-乙基丁酸 梯希愛（上海）化成發(fā)展有限公司；Fast DNASPIN試劑盒 美國MP Biomedicals。

PHS-25 pH計 海力辰邦西儀器科技有限公司；UV-500 PC紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；7890 A氣相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；1525型液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥理化性質(zhì)分析 窖泥水分參考國標(biāo)GB 5009.3-2016采用烘干法；pH是將新鮮窖泥與去離子水按照1:5 g/mL混勻靜置后用pH計檢測；有效磷參考地標(biāo)DB 34T 2266-2014，采用氟化銨-鹽酸比色法測定；銨態(tài)氮根據(jù)納氏試劑比色原理，采用紫外分光光度法；腐殖質(zhì)參考地標(biāo)DB 34T 2265-2014，采用重鉻酸鉀氧化法測定。

有機酸的測定均采用相同的前處理方法，將新鮮窖泥與15%甲醇按照1:9 g/mL混勻，超聲處理20 min 再次混勻，8000 r/min 離心10 min，用0.22 μm有機濾膜過濾后測定有機酸。丁酸與己酸采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法定量，將前處理樣品加2-乙基丁酸作為內(nèi)標(biāo)，色譜柱采用 DB-Wax（Agilent 30 m×0.25 mm），進樣量1 μL，柱流速1 mL/min，進樣口溫度250 ℃，分流比30:1。升溫條件：初始溫度35 ℃，2 ℃/min升溫至 60 ℃，保持 4 min；6 ℃/min升溫至 195 ℃，保持20 min。氫火焰離子檢測器溫度250 ℃。乙酸與乳酸的測定采用高效液相色譜法，色譜柱采用Ultimate LP-C（Welch 4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測器采用Waters 2996二極管陣列檢測器，進樣量15 μL，檢測波長210 nm。流動相：磷酸二氫鉀緩沖液（0.01 mol/L，pH2.50）:甲醇=95:5，流速 0.6 mL/min。

1.2.2 窖泥微生物基因組的提取與高通量測序 將采集到的樣品用自封袋分裝后采用干冰轉(zhuǎn)運，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行 Illumina MiSeq高通量測序。窖泥微生物總基因組DNA采用Fast-DNASPIN 試劑盒進行提取，338F_（5’-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3’）與 806R_（5’-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3’），擴增微生物 16S rRNA 基因的 V3～V4區(qū)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測序數(shù)據(jù)采用 Flash（1.2.11）和 Fastp（0.19.6）進行拼接和質(zhì)控，采用Mothur（1.30.2）進行多樣性分析，采用QIIME軟件（V1.9.1）生成各分類學(xué)水平豐度表，多樣性距離計算，窖泥理化與樣本和微生物之間的冗余分析（RDA）分析借助美吉生信云平臺進行分析，采用SPSS 25進行單因素方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新老窖池窖泥理化性質(zhì)分析

窖泥的理化如表1所示，新老窖泥的含水量均隨窖泥深度增加而降低，pH隨窖泥深度增加而升高，除new_02窖泥含水量高于old_02外，同一深度的老窖泥中水分含量和pH高于新窖泥，該結(jié)果與前人研究相一致。表層窖泥含水量高、pH低的原因可能是此部分窖泥與呈酸性的黃水直接接觸，含水量高的窖泥致密性更強，厭氧效果也更好。老窖泥中的有效磷含量高于新窖泥，老窖池中有效磷含量隨窖泥深度增加先上升后下降，新窖池中的有效磷含量隨窖泥深度增加而增加。有效磷是微生物生長繁殖和代謝的必要元素，但含量控制在一定范圍（1.5～3.0 g/kg），過高的濃度可能會導(dǎo)致窖泥板結(jié)，影響窖泥微生物活動致使窖泥退化，本次檢測的老窖池中有效磷含量適宜，新窖池中含量偏低，在新窖泥養(yǎng)護中應(yīng)適量添加含磷介質(zhì)。氨態(tài)氮的含量與窖泥質(zhì)量呈明顯正相關(guān)，在本文研究中發(fā)現(xiàn)老窖池中氨態(tài)氮含量遠高于新窖泥，老窖池不同深度的窖泥中含量差異不明顯，在新窖池中隨窖泥深度增加而增加，新窖泥在深層質(zhì)量更好。腐殖質(zhì)是由微生物分解有機質(zhì)產(chǎn)生的，其含量可以用于判斷窖泥質(zhì)量，有學(xué)者對不同腐殖質(zhì)含量的窖泥在實際生產(chǎn)中進行了驗證，發(fā)現(xiàn)窖泥腐殖質(zhì)含量高低與所產(chǎn)的原酒中己酸乙酯含量有相關(guān)性，但在本研究中發(fā)現(xiàn)新老窖泥中腐殖質(zhì)含量均隨窖泥深度的增加而降低，并且各層之間差異顯著（＜0.05）。這可能是由于表層窖泥微生物與有機質(zhì)含量高糟醅直接接觸，代謝旺盛產(chǎn)生的，而深層窖泥有機質(zhì)含量較低。

表1 新老窖池池底窖泥理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of bottom pit mud from old and new pit cellar

窖泥中原核微生物可以產(chǎn)生各種有機酸。有機酸作為酯類物質(zhì)的底物，參與了糟醅中風(fēng)味化合物的形成。己酸、丁酸、乳酸和乙酸是濃香型白酒典型風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體物質(zhì)。隨窖泥深度的增加，有機酸的含量均降低。相比于乳酸和乙酸，新老窖池中不同深度窖泥中己酸和丁酸含量差異不明顯。根據(jù)Zhou等的研究，老窖池中有機酸代謝的途徑更為活躍，但新窖池中乳酸和乙酸含量明顯高于老窖池，這可能與新窖池中占據(jù)主導(dǎo)相關(guān)，乳酸含量的高低可以作為窖泥成熟的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 窖泥中原核微生物α多樣性指數(shù)分析

對所有測序序列進行過濾，30個窖泥樣品的平均長度為416 bp。每個樣本的讀取次數(shù)從33172到68678。在97%的水平，所有優(yōu)質(zhì)序列分成4838 OTUs。樣本中優(yōu)質(zhì)序列的覆蓋率均大于99%，說明細菌微生物群落具有較好的代表性。

如表2所示，Shannon指數(shù)隨窖泥深度增加而增加，Simpson指數(shù)隨窖泥深度降低，表明越深層窖泥微生物多樣性越高；對比新老窖池發(fā)現(xiàn)，老窖池的微生物多樣性更高。老窖池物種豐富度（Chao指數(shù)、Ace指數(shù)和Sobs指數(shù)）隨窖泥深度增加，表層0～4 cm與深層4～10 cm存在顯著差異（＜0.05)；而新窖池表層0～2 cm物種豐富度最大，總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但各層間無顯著性差異（＞0.05）。對比新老窖池的微生物豐富度可以看出，老窖池的層次較為分明，老窖池微生物豐度低于新窖池，這可能是超過30年的窖泥存在退化的原因。

表2 新老窖池池底窖泥原核微生物群落α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of prokaryotic community in pit mud from old and new pit cellar

從多樣性可以看出，窖泥微生物的多樣性和豐度呈現(xiàn)出層次差異。如圖2所示，對新老窖池不同深度窖泥微生物的物種多樣性進行組間非度量多維排列（NMDS）比較分析表明，老窖池0～4 cm和4～10 cm深度的窖泥微生物更緊密地聚集在一起；新窖池呈現(xiàn)相似的規(guī)律，但新窖池4～6 cm更趨向于過渡階段，在兩個分組中均有出現(xiàn)。

圖2 基于新老窖泥細菌群落Bray-Curtis相似性的NMDS排序Fig.2 NMDS ordination based on Bray-Curtis similarities of bacterial communities at old and new PM

2.3 窖泥中原核微生物門層面分析

如圖3A所示，在老窖泥樣品中微生物共檢出35個門，有18個門在所有深度中均存在。如圖3B所示，在新窖池中共檢測到43個門，有21個門在所有深度中均存在。如圖4所示，老窖泥中占比最高的是厚壁菌門（Firmicutes，78.25%），其次是擬桿菌門（Bacteroidota，10.06%），占比超過1%的還有互養(yǎng)菌門（Synergistota，4.02%）、Patescibacteria（2.4%）、Caldatribacteriota（1.45%）和放線菌門（Actinobacteriota，1.31%）。新窖泥中占比最高的也是厚壁菌門（Firmicutes，95.22%），其次是變形菌門（Proteobacteria，2.43%）和放線菌門（Actinobacteriota，1.75%）。隨窖泥深度的增加，微生物的門類也相應(yīng)增加。無論是老窖泥還是新窖泥，厚壁菌門始終在窖泥微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位，該發(fā)現(xiàn)與前人研究相似。

圖3 新老窖池不同深度窖泥微生物門水平Veen圖Fig.3 Veen diagram of different depths new and old PM at phylum level

圖4 新老窖泥門水平物種占比情況Fig.4 The proportion of microbial in old and new PM at phylum level

2.4 窖泥中原核微生物屬層面分析

對老窖池的多樣性檢測發(fā)現(xiàn)，相比于新窖池，老窖池的微生物多樣性更高。進一步對窖泥微生物群落屬層面的分析也進一步驗證了這一結(jié)論，豐度占比超過0.01%的微生物有37種，而新窖池相對豐度占比0.01%只有16種。如圖5A所示，通過對比老窖泥不同深度的微生物占比發(fā)現(xiàn)，在淺層窖泥中占據(jù)主導(dǎo)地位，深層窖泥中和占據(jù)主導(dǎo)。和是重要的釀造功能菌。占比隨窖泥深度的增加而降低，在表面0～2 cm的窖泥中占比最高為41.29%，而深層窖泥中占比卻低于1%，與前人研究一致。屬的微生物占比隨窖泥深度增加先上升后下降，在4～6 cm的中層占比最高為23.9%。在6～8 cm窖泥中占比最高，為18.71%。根據(jù)前人的研究，和在窖泥成熟穩(wěn)定中扮演重要的角色，與乳酸呈負相關(guān)。新窖池占比超過0.01%的微生物有16個屬，如圖5B所示，乳酸菌（）在窖泥各個深度中所占比例最高，在表層2～4 cm窖泥中所占比例最高（74.7%），但其占比隨著窖泥深度的增加而下降。芽孢桿菌（）、梭菌（12）和的隨著深度的增加占比增加，成為深層窖泥微生物的優(yōu)勢菌群，這可能與深層窖泥的厭氧環(huán)境有關(guān)，有利于芽孢桿菌、梭狀芽胞桿菌等專性厭氧微生物的生存。在屬水平上，不同深度的微生物群落演替存在顯著差異，說明微生物群落在垂直方向上演替顯著。

圖5 新老窖池窖泥樣本與微生物菌群屬水平Circos圖Fig.5 Circos diagram for microflora structure in PM samples of old and new pit cellar at genus level

2.5 窖泥理化性質(zhì)與微生物樣本冗余分析

如圖6所示，RDA的結(jié)果分別解釋了老窖池54.00%和新窖池57.21%樣本與微生物理化的關(guān)系，新老窖池不同深度樣品對應(yīng)的理化具有相似的分布情況。新老窖池中淺層窖泥（0～4 cm）與理化因子水分、己酸、丁酸、乳酸和乙酸和腐殖質(zhì)正相關(guān)，深層窖泥（4～10 cm）與理化因子氨態(tài)氮、有效磷和pH正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與陶勇對2～50年不同窖齡窖泥與理化因子的相關(guān)性中有效磷、pH和氨態(tài)氮對微生物群落結(jié)構(gòu)影響相同。不同的是，老窖池淺層窖泥與微生物正相關(guān)，能夠促進己酸的產(chǎn)生。有研究表明，隨窖齡增加其相對豐度增加。深層與微生物和正相關(guān)。新窖池淺層窖泥與微生物正相關(guān)，深層窖泥與微生物和12正相關(guān)。根據(jù)對窖泥微生物的研究，這兩類微生物參與窖泥的老化成熟。

圖6 窖泥理化指標(biāo)和微生物群落樣本冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of physicochemical indexes and microbial community in pit mud

2.6 有機酸與窖泥微生物相關(guān)性分析

濃香型白酒有機酸中，己酸、丁酸、乳酸和乙酸構(gòu)成總酸的90%以上。窖池中產(chǎn)生有機酸的微生物主要來自窖泥，為了揭示窖泥中產(chǎn)有機酸微生物，本文用熱圖展現(xiàn)了有機酸與相對豐度排名前20的微生物屬間的Spearman相關(guān)系數(shù)。從圖7A可以看出，老窖池中微生物聚為2類，其中、與四種有機酸呈正相關(guān)，為老窖池中有機酸合成關(guān)鍵微生物。與己酸合成正相關(guān)的微生物有4種，分別是、、和。如圖7B所示，新窖池中與有機酸相關(guān)的微生物同樣聚為 2類，其中、和與除丁酸外的有機酸呈正相關(guān)，是新窖池中主要有機酸合成的關(guān)鍵微生物。主要代謝產(chǎn)物為己酸、丁酸、乙酸和氫氣，在新老窖池中均參與有機酸的生成。

圖7 窖泥有機酸與微生物相關(guān)性熱圖Fig.7 Heatmap of correlation between pit mud organic acid and microorganism

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序分析了3、30年新老窖池不同深度窖泥的原核微生物群落演替，結(jié)合理化相關(guān)性分析，得到結(jié)論：新老窖池理化存在顯著差異，老窖池中水分、pH、有效磷、氨態(tài)氮含量普遍高于新窖池；新窖泥中乳酸和乙酸含量明顯高于老窖泥，乳酸含量的高低可以成為成熟窖泥的評價指標(biāo)。新老窖池微生物存在顯著差異，老窖池的微生物多樣性更高而豐富度低，和是老窖泥中的優(yōu)勢微生物 ，、和是新窖泥的優(yōu)勢微生物。垂直維度存在明顯群落演替。深度4 cm是區(qū)分表層深層的分界線；隨窖泥深度的增加，和成為老窖泥中優(yōu)勢微生物，和12成為新窖泥的優(yōu)勢微生物。新老窖泥理化關(guān)聯(lián)分析具有相似性，新老窖池深層窖泥與理化因子氨態(tài)氮、有效磷和pH均呈正相關(guān)；新老窖泥有機酸關(guān)聯(lián)分析具有差異性，、是老窖池中有機酸合成關(guān)鍵微生物，、和是新窖池中主要有機酸合成的關(guān)鍵微生物。

綜上，本研究系統(tǒng)測定了垂直維度不同深度新老窖池池底窖泥的理化與微生物菌群結(jié)構(gòu)，首次提出4 cm是區(qū)分窖泥深淺的分界線，并通過冗余分析闡明了不同深度樣本與理化因子的相關(guān)性，并與有機酸進行關(guān)聯(lián)，找出了與有機酸生成相關(guān)的微生物，豐富了新老窖泥在垂直維度上的研究，對于指導(dǎo)窖泥養(yǎng)護和科學(xué)研究采樣具有一定現(xiàn)實意義。