基于1H NMR和GC-MS技術(shù)評價不同干燥方法對酸棗仁活性成分及抗氧化活性的影響

解玉軍，閆 艷 ，李 澤，裴香萍，王 瑞，杜晨暉,

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西太原 030619；2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原 030006）

酸棗仁（Ziziphi Spinosae Semen，ZSS）來源于鼠李科植物酸棗（Mill.var.（Bunge） Hu ex H.F.Chou）的成熟種子，具有養(yǎng)心補肝、寧心安神功效，可用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴。酸棗仁具有改善睡眠、抗氧化、保護心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫功能等多種作用。酸棗仁含有豐富的三萜皂苷、黃酮、生物堿、脂肪酸、氨基酸、多糖等成分。酸棗仁不僅應(yīng)用于中醫(yī)藥臨床用藥及中藥工業(yè)中，還廣泛應(yīng)用于功能性食品，如酸棗仁油軟膠囊、酸棗仁乳飲料等。

目前酸棗仁產(chǎn)地加工常采用濕法脫果肉，即新鮮酸棗通過水浸泡、水沖洗去除果肉，所制得的酸棗核經(jīng)晾曬、粉碎等制備工序，最終制得酸棗仁。酸棗仁傳統(tǒng)加工環(huán)節(jié)，極易導(dǎo)致水污染和黃曲霉毒素污染；并且在反復(fù)晾曬過程中，易導(dǎo)致酸棗仁中化學(xué)成分發(fā)生酶解等不良反應(yīng)，嚴重影響酸棗仁質(zhì)量。針對上述問題，運用工業(yè)中常規(guī)干燥方法干燥酸棗仁成為其加工過程中亟需解決的重要問題。但是干燥處理是否會影響酸棗仁藥材品質(zhì)，未見相關(guān)研究報道；同時選擇何種干燥方式更有利于降低干燥過程對酸棗仁品質(zhì)的影響，也是值得深入探討的問題。因此，亟需評價不同干燥方法對酸棗仁品質(zhì)的影響，從而為酸棗仁的干燥加工方法奠定研究基礎(chǔ)。

目前，酸棗仁在加工過程常采用傳統(tǒng)的曬干、陰干等干燥方法。而熱風(fēng)干燥（Hot air drying，HAD）、冷凍干燥（Freeze drying，F(xiàn)D）、真空干燥（Vacuum drying，VD）等方法在干燥效率、時間消耗和保證干燥樣品質(zhì)量方面均顯示出一定的優(yōu)勢。例如，HAD干燥成本低，易于控制。FD是保存營養(yǎng)成分和色澤的首選干燥方法。此外VD可以在一定程度上隔絕干燥樣品與氧氣，通常具有更高的干燥速率，并且可以獲得質(zhì)量較佳的干燥樣品。近年來，分析儀器的巨大進步使代謝組學(xué)技術(shù)得到迅速的發(fā)展，同時應(yīng)用不同的分析技術(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量的評價是必不可少的。氫核磁共振技術(shù)（H nuclear magnetic resonance，H NMR）可以同時檢測植物組織中初級和次級化合物，具有方法便捷、準確、重現(xiàn)性好，且其信號強度能夠反映樣本中化合物濃度及其相對含量的優(yōu)點。同時，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）具有較高的檢測靈敏度和定量準確性，通過與標準譜圖庫比對可實現(xiàn)化合物結(jié)構(gòu)的快速鑒定。代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于考察不同干燥方法對食品、中藥有效成分影響的研究中。張毅航等采用高效液相色譜技術(shù)和氣相離子遷移譜技術(shù)測定并比較熱風(fēng)干燥和冷凍干燥對猴頭菇菇蓋和菇柄風(fēng)味物質(zhì)的影響；MFN等采用H NMR代謝組學(xué)技術(shù)考察不同干燥方法對褐藻、多囊馬尾藻中代謝物的影響。目前，尚沒有應(yīng)用代謝組學(xué)方法考察不同干燥方法對酸棗仁中化學(xué)成分及其活性影響的系統(tǒng)研究。

因此，本研究整合H NMR和GC-MS技術(shù)，評價HAD、FD、VD等3種常規(guī)干燥方法對酸棗仁化學(xué)成分的影響。采用1,1-二苯基苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2′-氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽）（2,2’-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力和鐵還原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）等實驗考察不同干燥方法對酸棗仁抗氧化能力的影響。應(yīng)用偏最小二乘（partial least squares，PLS）相關(guān)分析，進一步明確差異性化合物、抗氧化活性和干燥方法之間的相關(guān)性，以期闡明干燥方法對酸棗仁品質(zhì)的影響，為制定合理的酸棗仁產(chǎn)地加工規(guī)范提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗 2019年9月于山西省晉中市榆次區(qū)烏金山鎮(zhèn)（東經(jīng) 112°44'52"，北緯 37°46'2"）采集成熟酸棗果實。經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定為鼠李科植物酸棗（Mill.var.（Bunge） Hu ex H.F.Chou）的成熟果實，樣品標本（編號20190913004）保存于山西中醫(yī)藥大學(xué)；棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、二十烷酸和DPPH 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；十七烷酸和-生育酚阿拉丁公司；3-（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（sodium-3-（trimethylsilyl） propionate-2,2,3,3-d4，TSP） 青島騰龍微波科技有限公司；ABTS、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（2,4,6-tri（2-pyridyl）-1,3,5-triazine，TPTZ）Solarbio科技有限公司；氘代甲醇（99.8%） 德國達姆施塔特公司；重水（DO） Sigma-Aldrich公司；硅烷化試劑（雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷） REGIS Technologies公司；正己烷（色譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他化學(xué)品和試劑均為分析純。

LGJ-10C型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；BGZ-76型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DZF-6050型真空干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-6100S紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；DL-5-B低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；IKA A11研磨機 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；FA3204B電子天平上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；600.13 MHz AVANCE III NMR Spectrometer 德國布魯克公司；Agilent 7890B-5977B型GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將新鮮酸棗脫去果肉，用水快速沖洗除去果核上殘留的果肉，晾干表面水分備用。測定未干燥酸棗仁的初始含水量為21.03%。所有的酸棗核樣品均保存在4 ℃條件下。參考本團隊前期工作內(nèi)容，分別稱取24份酸棗核，每份70 g均勻放入搪瓷托盤中，按以下方法處理。熱風(fēng)干燥（HAD）：使用鼓風(fēng)干燥箱干燥7 h，溫度為60 ℃；真空干燥（VD）：使用真空干燥箱干燥5 h，溫度為60 ℃，真空度為1.0 kbar；冷凍干燥（FD）：放于冷凍干燥機中干燥36 h，凍干壓力為20 Pa，冷凝溫度-50 ℃。每種干燥處理平行8份進行。

干燥完成后破除果核，獲得酸棗仁并稱量重量，將酸棗仁用研磨機粉碎后過3號篩，密封保存于4 ℃。水分含量測定參照《中國藥典》四部中水分測定法第二法（烘干法）進行測定。所有樣品干燥至水分含量均符合《中國藥典》一部中酸棗仁項下規(guī)定≤9%。

1.2.2H NMR分析

1.2.2.1 樣品及對照品溶液制備 精密稱取干燥后的酸棗仁粉末約0.2 g，平行8份，參照Yan等的方法制備樣品溶液，用于1DH NMR、2DH NMR測定。精密稱取酸棗仁皂苷A、白樺脂酸、6′′-阿魏酰斯皮諾素、斯皮諾素對照品各5 mg，加氘代甲醇1 mL超聲溶解；精密稱取木蘭花堿5 mg，加氘代氯仿 1 mL 超聲溶解，室溫下離心（13000 r/min，25 min），移取上清液700 μL于5 mm核磁管中用于H NMR測定。

1.2.2.2 分析條件 酸棗仁H NMR測定方法參考Yan等的方法。1DH NMR分析在25 ℃下于600 MHz核磁儀上進行（頻率600.13 MHz），掃描次數(shù)為64，譜寬12345.7679 Hz，傅里葉變換頻率0.188 Hz，脈沖間隔D1為 1 s，延遲時間為 5.0 s。采用 Noesygppr1d序列壓制水峰，用氘代甲醇進行鎖場，內(nèi)標為TSP。2DH NMR（H-H COSY）分析在 25 ℃ 下于600 MHz核磁儀上采集，光譜寬度6602.11 Hz，采集時間0.15 s，掃描延遲1 s，掃描次數(shù)為16。

H NMR圖譜采用Mest ReNova 14.0進行處理，核磁圖譜經(jīng)過定標、相位、基線校準后，以0.01積分段對化學(xué)位移區(qū)間0.6～9.5進行分段積分，其中4.77～5.03（殘余水峰）和3.30～3.3（殘余甲醇峰）不進行積分。將積分數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進行多元統(tǒng)計分析。采用GraphPad Prism 8.0軟件對差異化合物進行相對含量分析，繪制箱圖。2DH NMR數(shù)據(jù)采用MestReNova 14.0軟件對樣品和對照品圖譜進行比對，對酸棗仁中5個次級化合物進行指認并確定歸屬。

1.2.3 GC-MS分析

1.2.3.1 脂肪酸衍生化 酸棗仁脂肪酸衍生化方法參考Yan等的方法，并略作修改。脂肪油用正己烷溶解并定容至5 mL，精密移取50 μL脂肪油溶液和10 μL十七烷酸內(nèi)標溶液到180 μL衍生化試劑中，在 90 ℃ 下連續(xù)振搖（300 r/min）反應(yīng) 90 min，結(jié)束后冷卻至25 ℃，過0.22 μm微孔濾膜，用于GC-MS分析。

1.2.3.2 對照品溶液制備 分別使用正己烷為溶劑，制備7個對照品和內(nèi)標十七烷酸的標準溶液。然后將7個對照品溶液和內(nèi)標溶液混合制備混合對照品溶液：棕櫚酸0.80 mg/mL、亞油酸1.44 mg/mL、油酸 2.85 mg/mL、硬脂酸 0.40 mg/mL、二十烷酸0.20 mg/mL、角鯊烯 1.37 mg/mL和-生育酚0.80 mg/mL。用正己烷對混合標準溶液進行適當(dāng)濃度稀釋，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液。其中內(nèi)標溶液濃度為1.20 mg/mL。衍生化方法采用脂肪油衍生化方法處理。所有溶液保存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 儀器和分析條件 脂肪酸測定使用Agilent 7890B氣相色譜儀配備Agilent 5977B質(zhì)譜儀。色譜柱為 HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣（≥99.999%，中國），流速為1.0 mL/min，分流比為20:1，進樣量為0.2 μL，進樣口溫度250 ℃。程序升溫：起始溫度 150 ℃，保持 1 min，然后以5 ℃/min升至 215 ℃，保持 5 min，之后以 5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升至270 ℃保持10 min。傳輸線、離子源和四級桿溫度分別為280、230 和 150 ℃。掃描范圍 m/z 50～500，溶劑延遲3 min。采用SIM模式進行掃描。化合物通過與NIST 14數(shù)據(jù)庫進行匹配，對每個化合物進行鑒定，并通過與對照品的保留時間進行比較進一步確認。使用MassHunter定量軟件計算各化合物含量，每份樣品平行制備8份。

1.2.4 體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 酸棗仁70%乙醇提取液制備 準確稱取0.5 g 酸棗仁粉末，用70%乙醇超聲（功率為250 W）提取兩次，每次30 min，3500 r/min離心15 min，取上清液用70%乙醇定容至25 mL，測定其抗氧化活性。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率測定 DPPH自由基清除實驗參考Yan等的方法。精密稱定10.0 mg DPPH用無水乙醇定容至2.0 mL，使用時加無水乙醇稀釋至吸光度在0.7～0.8范圍內(nèi)。3.0 mL稀釋后的DPPH溶液分別加入1.0 mL逐級稀釋的不同濃度的酸棗仁70%乙醇提取液中（1.0、1.6、2.2、2.8、3.4、4.0 mg/mL），暗處靜置30 min后，在517 nm波長下以無水乙醇為空白對照，測定空白溶液吸光度（A），操作同前，測得樣品溶液的吸光度（A）。DPPH自由基清除率按公式（1）計算，結(jié)果使用半數(shù)清除濃度（IC）值表示。

1.2.4.3 ABTS陽離子自由基清除率測定 ABTS陽離子自由基清除實驗參考Zheng等的方法。將88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液和5.0 mL 10 mmol/L ABTS儲備液混合，于37 ℃條件下避光靜置過夜，使用時以無水乙醇稀釋至734 nm處吸光值為0.70±0.02。取4.0 mL ABTS稀釋液加入1.0 mL逐級稀釋的不同濃度的酸棗仁70%乙醇提取液中（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），暗處放置7 min 后，在734 nm波長下以無水乙醇為空白對照，測定空白溶液吸光度（A），操作同前，測得樣品溶液的吸光度（A）。ABTS陽離子自由基清除率按公式（2）計算，結(jié)果使用半數(shù)清除濃度（IC）值表示。

1.2.4.4 FRAP總還原能力測定 鐵離子總還原能力的測定方法參考Yan等方法。將300 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH=3.6）、20 mmol/L氯化鐵、10 mmol/L TPTZ（40 mmol/L HCl溶液定容）按 10:1:1（v/v/v）比例混合，37 ℃反應(yīng)10 min得FRAP工作液。精密吸取0.1 mL逐級稀釋不同濃度的酸棗仁70%乙醇提取液（2.0 mL，1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mg/mL），加2.0 mL蒸餾水，3.0 mL FRAP工作液，搖勻，避光放置20 min，于596 nm處以蒸餾水為空白對照測定吸光度。結(jié)果以每克干質(zhì)量酸棗仁中抗壞血酸質(zhì)量表示，單位為mg V/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SIMCA-P 14.1軟件進行多變量數(shù)據(jù)分析和PLS分析。使用Graphpad Prism 6軟件對不同干燥方法下的差異化合物進行箱圖分析。在PLS分析中，將ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的IC值轉(zhuǎn)換為1/IC值。實驗樣品平行測定3次，結(jié)果以平均值±標準差表示，用SPSS Statistics 20軟件進行ANOVA分析，并用Duncan's法進行多重比較，以＜0.05表示差異或相關(guān)性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NMR分析結(jié)果

2.1.1 酸棗仁中化合物的NMR分析鑒定 不同干燥方法的酸棗仁1DH NMR圖譜如圖1所示，通過分析每個化合物的化學(xué)位移、偶合常數(shù)及峰形等信息，結(jié)合文獻[10]并參照HMDB、BMRB數(shù)據(jù)庫和H-H COSY二維譜圖（圖2）對本實驗圖譜進行分析鑒定，共指認出38種化合物，如表1所示。H NMR圖譜大致可以分為3個區(qū)域：有機酸和氨基酸區(qū)（3.10～0.00）主要包括亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和乙酸等。糖區(qū)（5.50～3.10）鑒定的成分包括-葡萄糖、-葡萄糖、木糖等。芳香區(qū)（9.50～5.50）鑒定的成分包括鳥嘌呤、腺嘌呤、富馬酸和腺苷等。本部分主要針對H NMR圖譜中峰較為明顯的化合物進行分析描述。1.03（J=7.2 Hz）處的雙峰鑒定為纈氨酸的非對映異構(gòu)的甲基峰；在1.49（J=7.2Hz）和3.77（J=6.6 Hz）處的雙峰被認為是丙氨酸的甲基峰；在1.90處的單峰為乙酸的甲基峰；3.65處的單峰為吲哚乙酸的信號峰；-葡萄糖（J=4.2 Hz）和-葡萄糖（J=8.4 Hz）信號在5.23和4.59處分別被識別。各類化合物的核磁數(shù)據(jù)見表1。

表1 酸棗仁中主要化學(xué)成分的1H NMR圖譜數(shù)據(jù)歸屬Table 1 1H NMR assignments of the major components in ZSS

圖1 不同干燥方法的酸棗仁1H NMR圖譜Fig.1 1H NMR spectra of ZSS under different drying methods

圖2 次級化合物化學(xué)歸屬Fig.2 Chemical attribution of secondary compounds

2.1.2 NMR多元統(tǒng)計分析 將采集的H NMR數(shù)據(jù)進行積分，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進行多元統(tǒng)計分析。圖3為由主成分1（39.2%）、主成分2（13.8%）和主成分3（9.6%）為坐標構(gòu)建的主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖。HAD樣品與VD樣品、FD樣品經(jīng)t2軸分開，而VD樣品和FD樣品經(jīng)t1軸分開，3種干燥方法樣品均具有一定的分離趨勢，說明經(jīng)3種干燥方式處理后酸棗仁樣品所含化學(xué)成分存在一定差異。

圖3 不同干燥方法的酸棗仁1H NMR PCA散點圖Fig.3 1H NMR principal component scatterplot of ZSS with different drying methods

無監(jiān)督的PCA分析方法不能忽略組內(nèi)誤差，因此，需要采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）確定不同干燥方法之間的化學(xué)差異成分（圖4 A，D，G）。但是OPLS-DA的使用必須以PLS模型通過驗證為基礎(chǔ)，排列模型用于驗證OPLSDA模型的擬合程度。排列模型中Q回歸線與左邊縱軸均相交于零點以下，且左邊Q實驗值低于右邊的原始值，＜0.05（圖4 B，E，H），說明模型有效，可以繼續(xù)鑒定差異性化學(xué)成分。

將變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1作為篩選差異化合物的判定標準，并結(jié)合單因素方差分析（＜0.05）對差異化合物進行初步鑒定。VD和HAD兩組間共有15個差異性化合物（圖4 C），F(xiàn)D和HAD兩組間共有15個差異性化合物（圖4 F），VD和FD兩組間共有10個差異性化合物（圖4 I）。

圖4 酸棗仁1H NMR多元統(tǒng)計分析Fig.4 1H NMR multivariate statistical analysis of ZSS

2.1.3 差異化合物相對含量分析 為了最大限度地了解不同干燥方法對酸棗仁的影響，對上述確定的初級和次級差異化合物，利用相對峰面積繪制箱圖。圖5顯示了3種干燥方法對H NMR化合物的影響。FD樣品中6種初級化合物（肌酸酐、甘氨酸、蘇氨酸、吲哚乙酸、1,7-二甲基黃嘌呤和蔗糖）和4種次級化合物（酸棗仁皂苷A、白樺脂酸、木蘭花堿和6-阿魏酰斯皮諾素）等相對含量顯著高于HAD樣品（＜0.05）。VD樣品中的13個初級化合物（6個氨基酸、1個有機酸、4個生物堿和2個碳水化合物）和 3個次級化合物（白樺脂酸、木蘭花堿和 6′′-阿魏酰斯皮諾素）相對含量顯著高于HAD樣品（＜0.05）。此外，VD干燥樣品中6個氨基酸（亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，-氨基丁酸，谷氨酰胺）、1 個有機酸（乙酸）、2個生物堿（甜菜堿，肉毒堿）和1個碳水化合物（-葡萄糖）相對含量高于FD樣品（＜0.05）。

圖5 差異化合物相對含量變化Fig.5 The change of relative content metabolites in ZSS

總體來說，在不同的干燥過程中，VD能保留更多的初級化合物（氨基酸和碳水化合物），而FD能夠保留更多的次級化合物。相比之下，HAD會導(dǎo)致更多的初級和次級化合物的損失。

2.2 GC-MS分析結(jié)果

脂肪酸類成分是酸棗仁化學(xué)成分的重要組成部分，脂肪酸類成分含量在22.09%～31.10%之間。其中亞油酸和油酸具有鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化和改善記憶的功能；而角鯊烯具有心血管保護和抗腫瘤作用；生育酚是一種天然的抗氧化劑，用于治療老年癡呆和心血管疾病；棕櫚酸等在非酒精性脂肪性肝病的預(yù)防治療中發(fā)揮重要作用。而棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、二十烷酸、角鯊烯和-生育酚等7種成分在酸棗仁中含量較高，因此本研究選取以上7種脂肪酸進行定量分析。

2.2.1 方法學(xué)考察結(jié)果 根據(jù)Cai等的方法，使用分析物對內(nèi)標（Y）的響應(yīng)比與分析物濃度對內(nèi)標濃度（X）的響應(yīng)比建立回歸方程。棕櫚酸、十七烷酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、二十烷酸、角鯊烯、生育酚方法學(xué)考察結(jié)果見表2、表3。各標準曲線的相關(guān)系數(shù)（）值均大于0.9954。分別以3倍和10倍信噪比計算得到每個分析物的LOD和LOQ，LOD和LOQ 的 范 圍 分 別 在 1.93～14.30 μg/mL 和 2.76～17.88 μg/mL之間，表明所用方法對酸棗仁中微量成分的檢測具有較高的靈敏度（表2）。通過分析24 h中6個重復(fù)的QC樣品和連續(xù)3 d的重復(fù)實驗來評估日內(nèi)和日間的精度。日內(nèi)精度的RSD（%）范圍為0.46%～1.69%，日間精度范圍為 0.32%～4.40%（見表3）。樣品穩(wěn)定性通過測定 0、2、4、6、8、12、24 h化合物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值計算RSD。用6個獨立的酸棗仁樣品進行重復(fù)性考察。結(jié)果如表3所示，所測化合物在48 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD＜2.48%，重復(fù)性的RSD為2.26%～4.49%。在2.0 g的酸棗仁粉末中加入已知含量的7種對照品化合物（50%、100%、150%）。然后，使用1.2.3項下方法提取并分析樣品。各化合物的回收率（%）按下式計算：（檢出量-原有量）/加入量×100。平均回收率均在98.01%～105.59%之間，且RSD均≤3.60%（見表3）。

表2 酸棗仁脂肪酸回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、LOD和LOQTable 2 Regression equation, correlation coefficient, linear range, LOD and LOQ of ZSS fatty acids

表3 酸棗仁脂肪酸精密度、穩(wěn)定性重復(fù)性和加樣回收率Table 3 Accuracy, stability, repeatability and recovery of ZSS fatty acids

2.2.2 酸棗仁脂肪酸含量測定結(jié)果 采用上述GCMS方法測定VD、FD和HAD等3種干燥酸棗仁樣品中7種脂肪酸含量，色譜圖詳見圖6。從表4可知，與HAD相比，VD處理能顯著保留酸棗仁樣品中-生育酚、亞油酸和油酸的含量（＜0.05）；與FD相比，VD處理后樣品中棕櫚酸、亞油酸和油酸含量顯著高于FD（＜0.05）。因此，本研究結(jié)果表明VD處理對飽和脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸）和不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸）含量的保留均優(yōu)于其他干燥處理樣品。

表4 不同干燥方法酸棗仁中脂肪酸含量（n=8）Table 4 Fatty acids present in ZSS based on the different drying methods (n=8)

圖6 不同干燥方法酸棗仁脂肪油總離子流圖（TIC）Fig.6 Total ion chromatograms (TICs) of fatty acids under different drying methods

2.3 干燥方法對酸棗仁抗氧化活性的影響

對樣品抗氧化活性具有貢獻作用的化合物容易受到不同干燥方法的影響，因此有必要探討不同干燥方法對酸棗仁抗氧化活性的影響。采用ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、FRAP等方法對不同干燥方法處理的酸棗仁樣品進行抗氧化活性測定，見表5。FD和VD樣品的DPPH自由基清除能力最強，其IC值分別為2.82±0.15和2.92±0.09 mg/mL。FD對ABTS陽離子自由基的清除能力較強，IC為0.86±0.02 mg/mL。FD樣品的FRAP值最高（58.91±2.87 mg V/g），其次是 VD（57.37±3.76 mg V/g）。綜合分析以上結(jié)果表明，F(xiàn)D處理的酸棗仁樣品具有更高的抗氧化能力。

表5 不同干燥方法下酸棗仁抗氧化活性（n=8）Table 5 Antioxidant activity of ZSS under different drying methods (n=8)

2.4 不同干燥方法酸棗仁活性成分及抗氧化活性PLS分析

利用PLS模型表征H NMR差異化合物（VIP＞1、＜0.05）、脂肪酸、抗氧化活性和干燥方法之間的關(guān)系，由 PC1（57.6%）和 PC2（20.8%）構(gòu)建 Biplot圖（見圖7）。值得注意的是，PC1軸將HAD樣品與VD、FD樣品分開，而PC2軸將VD樣品與FD樣品分開。此外，脯氨酸（9）、甜菜堿（21）和二十烷酸（F5）3 個化合物與HAD位于PC1軸負軸，并遠離抗氧化活性，說明HAD處理對抗氧化活性具有負面影響。FD樣品中含有較高含量的酸棗仁皂苷A（4）、白樺脂酸（5）、木蘭花堿（15）、肌酸酐（17）、甘氨酸（23）、吲哚乙酸（25）、6′′-阿魏酰斯皮諾素（26）、1,7-二甲基黃嘌呤（28）和蔗糖（32），這些化合物與 ABTS?、DPPH?和FRAP聚在一起，表明上述化合物與抗氧化活性呈正相關(guān)。與FD相比，VD樣品與6種脂肪酸、7種氨基酸和2種碳水化合物距離較近，但是距離ABTS陽離子自由基、DPPH自由基和FRAP較遠，表明VD樣品具有相對較弱的抗氧化活性。總體來說，不同類型化合物對抗氧化活性的貢獻不同，F(xiàn)D樣品中差異性化合物對抗氧化活性的貢獻強于VD樣品中差異性化合物對抗氧化活性的貢獻，該結(jié)果與不同干燥方法樣品抗氧化活性測定結(jié)果一致。

圖7 不同干燥方法的酸棗仁成分與抗氧化活性的PLS分析Fig.7 PLS analysis between the constituents present and the antioxidant activity of ZSS under different drying methods

3 討論與結(jié)論

本研究采用H NMR和GC-MS技術(shù)，評價3種常規(guī)干燥方法（VD、FD、HAD）對酸棗仁化學(xué)成分和抗氧化活性的影響。經(jīng)H NMR技術(shù)鑒定出38種化合物，并找到22個差異化合物。通過對差異性化合物相對含量進行分析，發(fā)現(xiàn)FD干燥酸棗仁可以保留更高含量的次級化合物，如酸棗仁皂苷A、白樺脂酸、木蘭花堿和6-阿魏酰斯皮諾素等；VD干燥酸棗仁樣品中氨基酸和碳水化合物含量相對較高；而HAD干燥酸棗仁中對初級和次級化合物含量的保留較差。采用GC-MS技術(shù)對酸棗仁7種脂肪酸成分進行定量分析，結(jié)果表明VD干燥酸棗仁對脂肪酸的保留高于其他干燥方法。采用PLS相關(guān)分析分析不同干燥方法、活性成分以及抗氧化活性之間的關(guān)系，結(jié)果表明清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和FRAP等抗氧化活性與FD干燥酸棗仁樣品中差異性化學(xué)成分具有較強的相關(guān)性，而VD干燥酸棗仁樣品中差異性化學(xué)成分與抗氧化活性的相關(guān)性稍弱于FD樣品。

FD是將被干燥的物料前處理后在低溫下快速凍結(jié)，使其降到共晶點以下，然后在真空條件下加熱，使凍結(jié)的水分子升華而逸出物料的過程。可以保護熱不穩(wěn)定化合物的降解，并抑制水依賴生化反應(yīng)。在 FD 干燥酸棗仁樣品中，酸棗仁皂苷 A、6′′-阿魏酰斯皮諾素和木蘭花堿等次級化合物的相對含量較高，表明低溫和真空條件干燥可以保留更多的次級化合物。Mediani等研究表明黃酮、黃酮苷等次級化合物在FD干燥樣品中含量較高。同時，低溫條件下可以抑制酶活性，降低皂苷類成分發(fā)生酶水解反應(yīng)，并且避免了高溫下皂苷成分的分解或轉(zhuǎn)變。低溫和無氧條件同時可以降低生物堿成分發(fā)生水解、氧化等反應(yīng)。因此，F(xiàn)D干燥方法有利于保留中藥次級化合物。而HAD以熱空氣為干燥介質(zhì)，自然或強制地對流循環(huán)的方式與食品進行濕熱交換，與此同時由于物料表面汽化的結(jié)果，使物料內(nèi)部和表面之間產(chǎn)生水分梯度差，物料內(nèi)部的水分因此以汽態(tài)或液態(tài)的形式向表面擴散。HAD處理導(dǎo)致酸棗仁中更多的初級和次級化合物的損失，其原因可能是高溫可以使黃酮類成分發(fā)生水解、氧化和裂解等反應(yīng)，導(dǎo)致含量降低。

VD是指在標準大氣壓下干燥產(chǎn)品。它可能有一個較高的干燥速率，因為水分可以在低溫下蒸發(fā)，產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)已經(jīng)膨化，以增強熱和傳質(zhì)。真空干燥技術(shù)具有提高干燥速度和降低食材氧化程度等特點。VD干燥酸棗仁可以保留更多的氨基酸、脂肪酸和碳水化合物，這與已有研究結(jié)果一致。VD干燥樣品中氨基酸含量較高，這可能歸因于隨著溫度升高，氨基酸由結(jié)合態(tài)向自由態(tài)的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致了氨基酸含量的增加。VD干燥樣品中脂肪酸類成分含量較高，可能是由于VD過程中高溫（60 ℃）可以使脂肪氧合酶和過氧化物酶失活，以及真空與氧氣隔絕狀態(tài)下脂肪酸的氧化減弱，進而降低了酸棗仁中脂肪酸成分的損失。此外加熱處理（55～60 ℃）也會增加飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的含量。與VD相比HAD干燥樣品中氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、-氨基丁酸、谷氨酰胺、甘氨酸、蘇氨酸等含量減少，這可能是由于氨基酸在熱氣流下發(fā)生氧化所致。

現(xiàn)代藥理研究表明，機體的氧化應(yīng)激水平與神經(jīng)功能障礙以及神經(jīng)退行性疾病如睡眠障礙等密切相關(guān)，睡眠的一種生理機能就是防御氧化應(yīng)激。失眠會使抗氧化與氧化系統(tǒng)失衡，引起過度的氧化應(yīng)激，因此，抗氧化物質(zhì)對失眠、抑郁等疾病的改善具有積極的作用，有必要闡明酸棗仁中活性成分與抗氧化活性的關(guān)系。本研究中吲哚乙酸、蔗糖、肌酸酐、6′′-阿魏酰斯皮諾素、1,7-二甲基黃嘌呤、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸、木蘭花堿和甘氨酸等化合物與抗氧化活性呈較強正相關(guān)性，而脂肪酸、氨基酸等化合物與抗氧化活性具有較弱的正相關(guān)性。研究表明6′′-阿魏酰斯皮諾素具有一定的抗氧化活性，而酸棗仁皂苷A和白樺脂酸作為強抗氧化劑，可以提供大量的氫使抗氧化物質(zhì)再生。木蘭花堿和吲哚乙酸均能提供電子以發(fā)揮其抗氧化作用。脂肪酸通過雙鍵斷裂或提供氫質(zhì)子表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，而氨基酸可以使促氧化物質(zhì)無毒，并使已被氧化的初級抗氧化劑再生以發(fā)揮其抗氧化活性。此外，蔗糖和葡萄糖也被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性。因此，不同干燥方法可以通過影響酸棗仁中初級或次級化合物的含量，進而影響了其抗氧化活性。然而酸棗仁在干燥后抗氧化活性的變化是否影響了其改善睡眠作用，仍需要動物實驗進一步驗證。

綜上所述，不同干燥方法對酸棗仁初級和次級化合物的含量均會產(chǎn)生一定程度的影響，而次級化合物含量的變化對酸棗仁干燥樣品的抗氧化活性有更直接的影響，因此在酸棗仁干燥過程中應(yīng)特別關(guān)注次級化合物含量的變化。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)D是更適合酸棗仁的一種干燥方法，可以最大限度地保留酸棗仁中有效成分，有利于保證酸棗仁的質(zhì)量，并且FD技術(shù)的工業(yè)化程度較高，未來在酸棗仁產(chǎn)業(yè)中有著巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景。