鼠李糖乳桿菌MP108緩解細菌性腹瀉的作用研究

趙玥明，侯艷梅，趙怡晴

（1.東北農業大學食品科學系乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；2.海普諾凱營養品有限公司，湖南長沙 410011；3.湖南省食品科學與生物技術重點實驗室，湖南長沙 410125）

腸毒性大腸桿菌（Enterotoxic，ETEC）是發展中國家兒童腹瀉和旅行者腹瀉的主要原因之一。ETEC產生不耐熱腸毒素和耐熱腸毒素，改變腸道緊密連接的完整性，引發炎癥、腸道功能障礙，同時破壞細胞外離子通道、溶質通道和水通道，最終導致腹瀉。通常預防ETEC引起的腹瀉的藥物是抗生素，但這些藥物存在副作用，包括胃腸道不適、中樞神經系統反應異常、頭痛、頭暈等癥狀，長期使用不利于人體健康。近年來，包括有益的微生物代謝物、短鏈脂肪酸和益生菌在內調節腸道菌群的功能性食品引起了人們極大的研究興趣。腸道微生物群對維持宿主健康很重要，與腹瀉的發病機制具有密切的聯系。

乳桿菌是人體腸道菌群中重要的益生菌之一，可以促進短鏈脂肪酸產生菌的增殖，增加短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acid，SCFA）的含量，從而有助于抑制有害細菌。一項隨機雙盲安慰劑對照試驗結果表明，對 55名成年慢性腹瀉患者進行4周益生菌干預，發現植物乳桿菌CCFM1143可顯著改善排便頻率及糞便性狀，另外，CCFM1143可抑制白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）升高和胃動素下降，增加糞便中乙酸和丙酸含量，調節腸道菌群組成，表現為益生菌組患者的糞便菌群中，擬桿菌屬及埃格特菌屬等有害菌的豐度降低，阿克曼菌屬、及等有益菌屬的豐度增加。同樣，植物乳桿菌ZLP001也能夠降低ETEC致腹瀉小鼠血清中的 IL-6、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-，TNF-）、白細胞介素 8（Interleukin-8，IL-8）的表達和分泌，同時增加了SCFA的水平。國內一項小鼠研究發現給懷孕的小鼠或新生小鼠定植鼠李糖乳桿菌GG（LGG）可緩解子代的炎癥反應，保護腸道，當LGG活菌組的小鼠8月齡時，與長壽相關的細菌以及產SCFA的細菌豐度增加，盲腸中SCFA水平增加，抗氧化能力增強和DNA損傷減輕，進一步研究發現LGG的早期定植激活了SIRT1/AMPK/PGc-1通路，從而減輕腸道炎癥反應，而腸上皮細胞SIRT1沉默后，LGG的保護作用減弱。此外另一項關于鼠李糖桿菌GG株的研究證實，其可通過抑制病原體附著到細胞上來保護人結直腸腺癌Caco-2細胞免受ETECK88誘導的炎癥相關反應。這些研究表明乳桿菌具有通過調節腸道菌群及免疫應答緩解腹瀉癥狀的作用，然而不同菌株的緩解作用機制存在差異。本研究在細菌性腹瀉的臨床癥狀和炎癥應答變化的基礎上，進一步分析與細菌性腹瀉的發病機制密切相關的腸道菌群的變化，旨在擴充鼠李糖益生菌預防大腸桿菌誘導的細菌性腹瀉可能的作用機制，同時也為鼠李糖乳桿菌防治大腸桿菌腹瀉提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

24只雄性 SPF級BALB/c小鼠（6周齡，體重18～20 g） 購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（動物合格證編號：320727210100177965）；鼠李糖乳桿菌 MP108（MP108）購自愛益森生物科技有限公司；腸毒性大腸桿菌ETEC O78：K80（，ETEC） 購自中國工業菌種采集中心（北京）；血清TNF-、IL-6、IL-10、干擾素（Interferon，IFN-）、水通道蛋白 3（Aquaporin 3，AQP3）、鐵蛋白（Serum ferritin，ST）、Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）和免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）酶聯免疫試劑盒南京森貝伽生物科技有限公司；糞便DNA快速提取試劑盒 美國MP biomedicals有限公司；膠回收試劑盒 倍沃醫學科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、D-無水葡萄糖、無水乙酸鈉、牛肉浸膏、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳、半胱氨酸鹽酸鹽、蔗糖、甘油、乙醇、胰蛋白酶1:250（酶活力≥50000 U/g）等試劑 國藥集團化學試劑有限公司； Luria-Bertani（LB）培養基 青島海博公司；胃蛋白酶（豬源）1:3000 上海麥克林生化科技有限公司；蘇木精-伊紅（Hematoxylin and eosin，H&E）染色液 南昌雨露實驗器材有限公司。

ZHJH-C1115B型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司；SX-300高溫高壓滅菌鍋 SANYO公司（日本）；5424R高速冷凍離心機 Eppen-dorf 公司；Multiskan go 1510酶標儀 Thermo（美國）公司；Pannormic MIDI數字切片掃描儀 匈牙利3D Histech；HWS-150型恒溫恒濕培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；llumina miseq pe300高通量測序儀Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養及制備 將鼠李糖乳桿菌MP108接種至5 mL液體MRS培養基中，在正常空氣條件下于37 ℃恒溫培養箱中培養到平臺初期，獲得第一代活化菌液，重復操作，獲得第三代活化菌液。按Yang等的方法使用LB培養基培養毒性大腸桿菌ETEC O78：K80，即將挑取單菌落，轉入到LB液體培養基中，在180 r/min和37 ℃條件下搖動培養18 h左右，隨后在4 ℃下4000×g離心10 min，最后用無菌磷酸緩沖鹽溶液對細菌沉淀清洗，重懸于生理鹽水以用于動物實驗。

1.2.2 MP108菌株耐酸、耐膽鹽能力測定 按靳志強等的方法提前配制好模擬腸液和胃液。簡單來說，將胰蛋白酶加入pH=8.0滅菌生理鹽水中，配制成濃度為1 g/L并加入一定量膽鹽，過膜處理得到模擬腸液。而模擬胃液則是將胃蛋白酶溶于pH=3.0的滅菌生理鹽水中，調節濃度為3 g/L并過膜處理。將培養基中發酵好的鼠李糖乳桿菌MP108菌液以5000×g離心5 min收集1 mL菌體于兩個1.5 mL離心管內，棄上清，用生理鹽水洗兩遍菌體。其中一個離心管菌體分別重懸于模擬腸液和胃液中，使用分光光度計測得腸液和胃液OD值為1.250（此時菌濃度為1×10CFU/mL），通過平板計數和稀釋度換算進而得到加入模擬腸液和胃液中的菌量。另一個離心管加入等體積的生理鹽水作為對照，37 ℃培養4 h后進行平板活菌計數，每個稀釋度做兩個平行。

1.2.3 動物實驗及分組 24只雄性SPF級BALB/c小鼠（6周齡，體重18～20 g）飼養于實驗動物中心屏障環境內，動物實驗設計及實驗方法經倫理委員會批準許可（JN.No20210315b0400501[018]）。適應性喂養一周后，小鼠隨機分成空白對照組、模型組、MP108產品組，高劑量MP108產品組（n=6/組），詳細分組及處理見表1，益生菌溶液由鼠李糖乳桿菌MP108凍干粉溶于無菌生理鹽水配制而成，MP108產品組灌胃劑量為36.9 mg/只/d，而MP108高劑量組的灌胃劑量為184.5 mg/只/d。第三周時，在飲用水中加入鏈霉素（5 g/L）處理3 d，將小鼠腸道菌群擾亂。然后用無菌水代替含有鏈霉素的水，造模前18 h前停止進食。從本周第4 d開始，空白對照組每天灌胃3次生理鹽水，模型組先灌胃1次生理鹽水，然后每天灌胃2次濃度為1.2×10CFU/mL的ETEC O78:K80懸液，每只小鼠灌胃0.2 mL，連續灌胃4 d，每次間隔2 h，灌胃ETEC后更換鼠籠，不添加墊料，而是在鼠籠中鋪濾紙，每隔2 h觀察小鼠的腹瀉情況和死亡率，持續4 d；其余各組則分別先灌胃相應產品的溶液，然后每天再灌胃2次濃度為1.2×10CFU/mL的ETEC O78:K80懸液，每只小鼠每次灌胃0.2 mL，其余處理同模型組小鼠。

表1 實驗分組及處理Table 1 Experimental groups and treatments

1.2.4 實驗指標測定

1.2.4.1 小鼠糞便含水量測定 小鼠處死前一天，收集小鼠糞便，按Lee等的方法測量糞便含水量，測得凍干前后重量后進行計算。計算公式如下：（糞便凍干前濕重-糞便凍干后干重）/糞便凍干前濕重。

1.2.4.2 血清腹瀉相關蛋白及炎癥因子水平測定在最后一次灌胃的24 h后，從眶靜脈叢血樣采集，血液靜置，4000×g離心10 min，離心后取血清，置于-80 ℃冰箱保存，采用酶聯免疫吸附測定方法檢測小鼠血清中 AQP3、ST、TLR4、IgA、TNF-、IL-6、IL-10和IFN-的含量。

1.2.4.3 小鼠空腸病理癥狀變化 取部分空腸固定在4%的多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，然后利用石蠟切片機獲得5 mm厚的切片，之后進行蘇木精伊紅（H&E）染色。封片晾干之后，使用病理切片掃描儀，觀察染色切片，隨機采集圖像。

1.2.4.4 小鼠腸道菌群的變化 按照試劑盒說明采用FastDNA糞便提取試劑盒提取小鼠糞便的總DNA，以V3-V4區域進行聚合酶鏈式反應擴增，切膠后采用BIOMIGA純化試劑盒進行純化。DNA濃度測定后，以等摩爾濃度混合文庫，利用Illumina MiSeq高通量測序平臺進行16S rRNA測序。下機數據經過質控，基于QIIME2.0流程分析腸道菌群的變化。通過非度量多維尺度分析（Nonmetric multidimensional scaling，NMDS）的方法分析菌群的多樣性分析，利用線性判別分析（Linear discriminant analysis，LEfSe）方法分析組間差異菌群。

1.3 數據處理

本文中，所有的實驗數據均用平均值±標準誤差（mean±SEM）表示，數據統計學分析采用單因素ANOVA檢驗對各組平均值的差異進行分析。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌MP108的耐酸、耐膽鹽能力

利用耐酸耐膽鹽實驗測試鼠李糖乳桿菌MP108在胃液和腸液中的耐受能力。與對照組相比，經模擬腸液處理后，鼠李糖乳桿菌MP108活菌數下降（＜0.001），而胃液干預后鼠李糖乳桿菌MP108與對照組相比則無顯著性差異（圖1）。綜合分析表明鼠李糖乳桿菌MP108對酸和膽鹽具有較好的耐受能力，處理后的活菌數均大于1×10CFU/mL，說明該菌株在體內有潛力發揮其益生作用。

圖1 鼠李糖乳桿菌MP108菌株的耐酸耐膽鹽能力Fig.1 Acid and bile salt tolerance of Lacticaseibacillus rhamnosus MP108

2.2 鼠李糖乳桿菌MP108產品對糞便含水量和空腸組織形態的影響

細菌性腹瀉會導致小鼠糞便不成形，因此通過小鼠的糞便含水量可衡量腹瀉癥狀的變化。與空白組相比，模型組小鼠因腹瀉導致糞便含水量過多，說明腹瀉模型造模成功。與模型組相比較，MP108產品組及高劑量MP108產品組的糞便含水量顯著性降低（＜0.05），其中高劑量MP108產品組下降最為顯著（＜0.001），同時該組糞便含水量與空白組相當（圖2a）。

圖2 鼠李糖乳桿菌MP108產品對小鼠糞便含水量和空腸組織形態的影響Fig.2 Effects of Lacticaseibacillus rhamnosus MP108 product on fecal water content and jejunum morphology

空腸H&E染色的切片顯示空白組腸壁無空隙，固有層結構完整且正常，而模型組空腸腸壁變薄，腸壁有空隙，固有層結構松散；腸絨毛變短且失去正常形態，腸通道變寬，形態不完整，并且有少許炎癥細胞浸潤（圖2b）。MP108產品組及高劑量MP108產品組相較于模型組，癥狀明顯改變，腸道組織形態有一定的恢復作用，腸絨毛長度趨于正常，結構相對完整；腸壁空隙恢復，固有層結構正常，黏膜完整，細胞浸潤不明顯。

王春榮等認為絨毛結構在腸道受到外界病原菌的侵入或發生應激反應時，會因損傷而變短。這給予一定的啟發，益生菌鼠李糖乳桿菌MP108的攝入可以改善由于腸毒性大腸桿菌引起的小鼠空腸損傷。趙凱科等研究顯示使用葎草醇提物治療后與金黃色葡萄球菌感染致腹瀉的模型組小鼠相比癥狀明顯改變，小腸絨毛排列整齊，與空白組結構大致相同。另外研究發現植物乳桿菌在ETEC引起的腹瀉小鼠中改善了腸上皮屏障，此外對DSS誘導結腸炎小鼠，植物乳桿菌NCU116的胞外多糖EPS116通過減少免疫細胞浸潤、促進小鼠結腸隱窩的再生以及ISC（腸干細胞）增殖分化來修復腸道屏障，還改變了DSS小鼠的菌群結構，使腸道再生和聚糖代謝相關的微生物豐度增加，促使宿主產生更多的細胞增殖因子，與本文的研究結果相一致的是鼠李糖乳桿菌MP108產品灌胃后改善了腹瀉小鼠的小腸結構，使其與空白組小鼠的小腸形態相似，因此鼠李糖乳桿菌MP108產品具有恢復小鼠因腹瀉損傷的小腸結構變化的作用。

2.3 鼠李糖乳桿菌MP108產品調控腹瀉相關蛋白水平

AQP3可調控腸道內水分子的吸收，其含量升高則可降低糞便含水量；IgA可影響腸道微環境的免疫應答；ST和TLR4的表達則與炎癥細胞的浸潤密切相關。通過檢測小鼠血清中以上四種腹瀉相關蛋白含量，判斷鼠李糖乳桿菌MP108產品緩解腹瀉的作用。與空白組的IgA含量相比，模型組的IgA顯著降低（＜0.001）；MP108產品及高劑量MP108產品處理之后，IgA 含量顯著上升（＜0.01）（圖3a）。此外，高劑量MP108產品組還顯著提高AQP3的水平（＜0.001）（圖3b）。與空白組的 ST和 TLR4 相比，模型組的ST和TLR4水平顯著升高（＜0.001）；鼠李糖乳桿菌MP108產品可顯著降低ST和TLR4的表達（＜0.001）（圖3c和3d）。綜合說明鼠李糖乳桿菌MP108各產品組具有調節緩解細菌性腹瀉相關蛋白的作用，可能有助于緩解小鼠的腹瀉癥狀。

圖3 鼠李糖乳桿菌MP108產品對血清中腹瀉相關蛋白含量的影響Fig.3 Effects of L.rhamnosus MP108 product on diarrhea related protein content in serum

岳月等研究表明植物乳桿菌能夠緩解ETEC引起的腹瀉，給腹瀉小鼠灌胃植物乳桿菌可以增加AQP3的水平，降低ST和TLR4的水平，這些腹瀉相關蛋白水平的變化是其緩解腹瀉的原因之一。張睦清等研究表明車前子具有止瀉作用，作用機制與上調AQP3基因蛋白的表達水平，增加小腸對水的吸收、調節水液代謝有關。因此推測鼠李糖乳桿菌MP108產品可通過調控腹瀉相關蛋白水平進而有助于緩解腹瀉癥狀。

2.4 鼠李糖乳桿菌MP108產品降低血清炎癥因子水平

TNF-和IL-6含量的變化可能與腹瀉的發生和發展，甚至恢復密切相關。在模型組中兩者的含量均相比空白組顯著提高（＜0.001），而MP108產品組及高劑量MP108產品組該兩者的含量相比于模型組顯著降低（＜0.05）（圖4a和 4b）。IL-10 和IFN-在模型組中含量相比于空白組極顯著下降（＜0.01），而在MP108產品組及高劑量MP108產品組中IL-10和IFN-的水平相比于模型組則極顯著提高（＜0.01）（圖4c和 4d）。細菌性腹瀉引起小鼠血清中的炎癥因子的上調，灌胃鼠李糖乳桿菌MP108產品則有助于降低腹瀉小鼠血清中炎癥因子的水平。

圖4 鼠李糖乳桿菌MP108產品對血清中細胞因子含量的影響Fig.4 Effect of L.rhamnosus MP108 product on serum cytokine content

減輕炎癥，增加機體抗炎能力也是緩解腹瀉的途徑之一。丁曉潔等發現烏梅丸可以緩解腹瀉癥狀，與降低血清TNF-、IL-6含量有關。另一項研究顯示，有效緩解腹瀉的雙歧桿菌不僅降低了TNF-，此外還增加IL-10的含量。對炎癥因子的調節結果與本研究一致，鼠李糖乳桿菌MP108產品可以通過降低血清中 TNF-、IL-6的含量，增加IL-10和IFN-的含量，從而有助于緩解小鼠的腹瀉癥狀。因此，調控炎性細胞因子是鼠李糖乳桿菌MP108產品緩解ETEC引起的腹瀉的重要途徑之一。

2.5 鼠李糖乳桿菌MP108產品調節腹瀉小鼠的腸道菌群

2.5.1多樣性和多樣性 腸道微生物區系與宿主之間存在共生關系，這種共生關系可能受到ETEC發病機制的損害。國外一項人群實驗報道了在400名嚴重急性營養不良兒童中，補充益生菌（鼠李糖乳桿菌GG和動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12）可恢復患兒失調的腸道菌群，且益生菌的成功定殖可顯著降低腹瀉發病率。為研究鼠李糖乳桿菌MP108產品對細菌性腹瀉小鼠的腸道微生物結構和組成的影響，利用16S rRNA擴增測序技術分析腸道菌群的變化。基于Observed、Shannon、Simpson和Chao1指數，分別從OTU數量、物種及豐度、均勻度和物種間進化關系衡量組內菌群的多樣性。結果顯示，小鼠感染后，腸道菌群多樣性顯著降低，尤其體現在 Observed和 Chao1指數（＜0.001）（圖5a和5b）。干預后，MP108產品組及高劑量MP108產品組小鼠腸道多樣性有不同程度的升高，特別在Shannon和Simpson指數上顯著增加（＜0.01）（圖5c和5d）。說明模型組物種均勻度差異大，物種多樣性也遠遠低于其他組別，而通過灌胃鼠李糖乳桿菌MP108產品可有效提高腸道中物種的豐富度和多樣性。使用基于Bray-Curtis指數的NMDS分析小鼠腸道微生物多樣性，模型組與其他四組菌群結構差異大，并且MP108產品組及高劑量MP108產品組這兩個干預組之間的菌群結構也有一定的差異性（圖5e）。

圖5 鼠李糖乳桿菌MP108產品對小鼠腸道菌群的影響Fig.5 Effects of L.rhamnosus MP108 product on gut microbiota in mice

2.5.2 菌群組成和差異分析 相對于空白組腸道菌群門水平組成，造模后的模型組中Proteobacteria（變形菌門）相對豐度顯著增加，Firmicutes（厚壁菌門）相對豐度劇烈降低；而干預后，Proteobacteria豐度在兩個鼠李糖乳桿菌MP108產品組中明顯降低。并且兩個干預組中Actinobacteria（放線菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）豐度相較于模型組均增加，高劑量組的Actinobacteria豐度更高，而Bacteroidetes豐度增加不如MP108產品組（圖5f）。通過LEfSe分析發現，模型組的優勢菌屬是條件致病菌（大腸埃希菌志賀氏菌），在炎癥條件下具有較高的感染致病能力；在Bin等的研究中，ETEC誘導的腹瀉導致腸道微生物多樣性降低，的相對豐度升高。經過干預，鼠李糖乳桿菌MP108產品組中RC9 gut group，NK4A136 group，UCG_013，6，和則是優勢菌屬；而高劑量MP108產品組的優勢均屬則是GCA 900066225，UCG_002，和9（圖5g）。MP108產品組和高劑量MP108產品組中優勢菌種不同，優勢的菌屬均集中在產短鏈脂肪酸的菌屬中，因此，推測灌胃鼠李糖乳桿菌MP108產品增加腸道菌群的多樣性，提高產SCFA菌屬的豐度，例如，和是產丁酸鹽的關鍵菌，有助于調節小鼠腸道菌群結構和組成，從而改善小鼠的腹瀉癥狀。Liu等的研究表明葛根芩連湯逆轉了腸道微生物區系豐富度的下降，改變了腸道微生物結構，增加腸道菌群的多樣性，并顯著增加了（阿克曼氏菌屬），（擬桿菌屬），（梭菌屬）和（瘤胃球菌屬）等產生短鏈脂肪酸的菌屬的相對豐度，減輕豬的腹瀉癥狀。此外，在模型組小鼠腸道中豐度降低，這代表著腸道黏液層較薄，導致腸道屏障功能減弱及細菌毒素易位，因此，高劑量MP108產品增加的相對豐度有助于改善腸道屏障功能，降低腸道炎癥。RC9 gut group和NK4A136 group為產丁酸菌，對于維持腸道SCFA的水平具有重要的作用。羅伊氏乳桿菌CCFM8631通過增加，NK4A136 group等細菌的相對豐度和調節維生素B6代謝，從而改善高膽固醇血癥。此外，和NK4A136 group等細菌在鞣花單寧Geraniin處理后富集，有助于緩解高脂飲食誘導的代謝綜合征癥狀。綜上，MP108產品和高劑量MP108產品處理提高小鼠腸道中有益菌的豐度，有助于恢復腸道菌群的平衡，進而改善小鼠細菌性腹瀉的癥狀。

3 結論

產品中的鼠李糖乳桿菌MP108可以通過調節血清中腹瀉相關蛋白的水平（＜0.05），調節腸道微生物失衡，降低條件致病菌的相對豐度，從而有助于減少小鼠糞便的含水量（＜0.05）；此外，鼠李糖乳桿菌MP108產品通過抑制血清中促炎因子的表達（＜0.05），提高產SCFA菌群的相對豐度如，，，從而有助于改善腹瀉小鼠的小腸組織病理形態。綜合來說，鼠李糖乳桿菌MP108產品可能通過調節腸道微生物的組成及其代謝活動影響宿主的免疫應答及腹瀉相關蛋白的表達，從而有助于緩解小鼠的腹瀉癥狀。