臭氧水與副干酪乳桿菌Z21聯合處理對綠豆芽中大腸桿菌O157:H7的抑制機制

馬鑫敏，谷恒梅，楊衛星，趙 宇，康艷萍，陳 萍，張碧瑩

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

綠豆芽因其具有豐富的營養價值和良好的抗氧化活性而廣受消費者的關注。然而在其生產過程中，溫暖和潮濕環境為致病菌的生長提供了理想條件。其中，大腸桿菌O157:H7是常見的致病菌之一，大腸桿菌O157:H7容易在綠豆芽表面附著、生長繁殖形成生物膜，它不僅為細菌提供必需的營養物質，還保護細菌免受環境損害。形成的生物膜具有較強的黏附力，難以清除，增加了殺菌難度。因此，食用綠豆芽而導致的食源性疾病時有發生。數據顯示，在2011年德國發生了腸出血性大腸桿菌污染綠豆芽的事件，導致約4000人患病，47人死亡。

臭氧是一種強氧化劑，對食源性病原體具有顯著的抑制作用。臭氧能破壞微生物的細胞結構，使菌體蛋白質變性，破壞菌體酶系統，還能夠改變細胞膜通透性，使微生物失去生長繁殖能力。臭氧已被普遍應用于芽苗菜的殺菌處理。Singla等研究發現，臭氧水與蘋果酸單獨使用對蘿卜苗和菜豆苗中志賀氏菌的殺菌效果不明顯，兩者聯合處理殺菌效果顯著增加。Tachikawa等研究表明，臭氧水和氧化氫聯合處理可顯著提高熒光假單胞菌生物膜清除率。

乳酸菌是革蘭氏陽性球菌或桿狀菌，廣泛用于發酵食品的商業生產。它們除了能改變食物的風味、氣味、質地和營養成分外，還對致病菌有抑制作用。大量研究表明，乳酸菌的上清液可以抑制雞胸肉、牛肉、面包中的有害細菌。乳酸菌代謝產生多種抗菌化合物，包括有機酸、脂肪酸、細菌素、過氧化氫等代謝產物。因此，在食品中使用乳酸菌上清液能更有效地抑制細菌生長。副干酪乳桿菌是乳酸菌的一種，有研究發現，副干酪乳桿菌上清液對酸土脂環芽孢桿菌和黃曲霉有明顯的抑制作用。

臭氧水與其它方法聯合，可以提高殺菌效果。Baumann等研究發現，臭氧-超聲聯用與單一處理相比，其對單增李斯特菌的殺菌效果提升約30%；Yuka等發現臭氧有機酸聯合處理比單獨處理更能有效地降低金針菇上大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌的菌落總數。本實驗室前期從東北酸菜中篩選分離出具有較強抑菌作用的副干酪乳桿菌Z21，經實驗發現該菌株發酵上清液具有良好的抑菌效果。因此，本實驗采用臭氧水聯合Z21上清液方法對大腸桿菌O157:H7的殺菌效果及其殺菌機制進行研究，為臭氧水聯合Z21上清液處理應用于清除大腸桿菌生物膜和農產品殺菌保鮮提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

綠豆芽 長春市沃爾瑪超市；副干酪乳桿菌Z21 從東北酸菜中分離得到；大腸桿菌O157:H7 CICC 21530 由吉林農業大學食品安全實驗室保存；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、山梨醇麥康凱瓊脂基礎（sorbitol macconkay agar base，SMAC）、緩沖蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）、營養瓊脂培養基（nutrient agar，NA） 青島海博生物技術有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI） 上海生工生物工程股份有限公司；2.5%戊二醛水溶液上海遠慕生物科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 長春鼎國生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生物科技有限公司；臭氧水 采用臭氧發生器制備；其余試劑均為國產分析純。

UV-1800型紫外分光光度計 日本島津公司；HX-4GM型拍打式均質器 上海滬析實業有限公司；SU8010型場發射電子顯微鏡 日本日立公司；ZCA-10臭氧發生器 廣東中辰臭氧設備有限公司；DXR3顯微共聚焦激光拉曼光譜儀 賽默飛科技有限公司；BD LSRFortessa TM Cell流式細胞儀 BD Biosciences公司；VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗流程 圖1所示為臭氧水聯合Z21發酵上清液對綠豆芽中大腸桿菌O157:H7抑菌機制的實驗流程圖。

圖1 實驗流程圖Fig.1 Flow chart of the experiment

1.2.2 大腸桿菌O157:H7菌懸液及副干酪乳桿菌Z21發酵上清液的制備 大腸桿菌O157:H7接種于TSB培養基中，37 ℃培養24 h，4 ℃、8000 r/min離心10 min。將離心后的菌體用無菌去離子水清洗兩次，調整菌懸液濃度至10CFU/mL。將活化后的副干酪乳桿菌Z21菌體濃度約為10CFU/mL以1%接種量接種于MRS培養基中，37 ℃培養48 h，4 ℃條件下，8000 r/min離心20 min。上清液經0.22 μm無菌濾膜過濾，用無菌蒸餾水稀釋后置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 臭氧水的制備 采用ZCA-10型臭氧發生器制備臭氧水，用碘量法測定水中臭氧的濃度。制備濃度為0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L的臭氧水。為避免臭氧揮發，現用現配。

1.2.4 樣品處理 選擇新鮮的綠豆芽作為實驗材料。使用前在4 ℃冰箱儲存。用200 mg/L次氯酸鈉浸泡2 min，無菌蒸餾水清洗后晾干。將10 g經滅菌的樣品浸入裝有200 mL菌懸液的燒杯中，浸泡10 min，為了使大腸桿菌O157:H7粘附在樣品表面，置于無菌條件下干燥30 min，綠豆芽中大腸桿菌O157:H7接種量為6～7 lg CFU/g。

1.2.5 臭氧水、Z21發酵上清液聯合殺菌處理 不同濃度臭氧水處理：將接種后的樣品分別浸泡在濃度為0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L的臭氧水中處理10 min。不同體積分數的Z21發酵上清液處理：將接種后的樣品分別浸泡在體積分數分別為2%、4%、6%、8%、10%的Z21發酵上清液中處理10 min。在前期預實驗中發現，臭氧水濃度＞1.5 mg/L、Z21發酵上清液體積分數＞10%處理時綠豆芽會發生軟化，因此，為了保持綠豆芽的品質，選擇濃度范圍在0.1～1.5 mg/L的臭氧水，體積分數為2%～10%的Z21發酵上清液進行后續聯合處理實驗。參考Koivunen等的方法用于聯合處理，比較了不同濃度臭氧水0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L和副干酪乳桿菌Z21發酵上清液2%、4%、6%、8%、10%等 20種組合處理的協同殺菌效果。協同效應值計算公式如下：

式中：A為臭氧水聯合Z21發酵上清液處理后菌落總數的減少量；B為臭氧水單獨處理后菌落總數的減少量；C為Z21上清液單獨處理后菌落總數的減少量。正值代表協同作用、負值代表拮抗作用。

1.2.6 大腸桿菌O157:H7菌落總數的測定 在無菌操作條件下，將處理后的10 g綠豆芽放入含有90 mL 0.1%無菌BPW均質袋中，置于均質器中均質3 min。將1 mL均質樣品連續稀釋在9 mL BPW中進行10倍梯度稀釋，取1 mL樣液接種于SMAC瓊脂培養皿中，37 ℃培養箱中培養24 h后進行菌落計數。每個梯度重復3次。

1.2.7 臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7殺菌機制研究

1.2.7.1 大腸桿菌O157:H7細胞膜通透性的測定將培養至對數生長期的大腸桿菌O157:H7用PBS清洗，重懸，調整菌懸液濃度為10CFU/mL，首先用臭氧水處理5 min后加入終止液（0.85%氯化鈉溶液與0.5%硫代硫酸鈉），離心后用Z21發酵上清液處理5 min；以生理鹽水作對照處理10 min。處理結束后，離心去上清收集菌體，清洗，重懸。參考Saravanan等的方法，加入PI使其最終濃度均為50 μg/mL，37 ℃ 條件下避光染色 30 min 后，用流式細胞儀進行分析。

1.2.7.2 大腸桿菌O157:H7細胞結構的測定 參考王永剛等的方法，按照1.2.7.1節中的方法進行處理，將處理后的菌體用PBS清洗，用體積分數為2.5%的戊二醛溶液固定，在4 ℃下過夜。依次用體積分數50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進行脫水兩次，每次10 min。用乙酸異戊酯將乙醇置換兩次，室溫干燥。取少量菌體與200 mg KBr混合，壓片，使用傅里葉紅外光譜檢測儀進行檢測分析，檢測波數范圍 4000～500 cm，分辨率 4 cm，掃描次數32次。紅外光譜采用OMNIC軟件進行分析。

1.2.7.3 拉曼光譜分析大腸桿菌O157:H7細胞結構拉曼光譜采集激光波長為532 nm，激光強度為10 mW，每次測量的曝光時間為5 s。光譜范圍為200～2000 cm。在批量檢測中，激發光直接聚焦在細菌樣品溶液上。每個樣品測量三次。4 μL細菌樣品溶液用于拉曼光譜檢測。

1.2.7.4 大腸桿菌O157:H7微觀形態的觀察 參考Zhang等的方法，按照1.2.7.2節中的方法對大腸桿菌O157:H7進行處理，冷凍干燥后通過掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.8 臭氧水聯合 Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7生物膜的清除效果研究

1.2.8.1 對生物膜中大腸桿菌O157:H7活菌數的測定 參考劉蘭芝等的方法，將蓋玻片（2 cm×2 cm）用無水乙醇浸泡，超聲清洗4 h，用蒸餾水清洗干凈，121 ℃滅菌15 min。將無菌蓋玻片加入無菌TSB培養基中并接入大腸桿菌O157:H7（10CFU/mL），每天更換滅菌的TSB培養基，37 ℃連續培養5 d。樣品處理分為A：對照組、B：蒸餾水處理組、C：臭氧水聯合Z21發酵上清液處理組，將3組蓋玻片在含有10 mL PBS 的離心管中，低功率超聲10 min分離生物膜。將得到的菌懸液進行10倍梯度稀釋，涂布于NA瓊脂培養基測定殘存活菌數。每個測定重復三次取平均值。

1.2.8.2 對大腸桿菌O157:H7生物膜EPS的測定參考張承慧的方法，將3組蓋玻片用PBS洗滌后將其置于含適量PBS的離心管中，低功率超聲10 min分離生物膜，將得到的菌懸液4 ℃、12000 r/min 離心20 min。用0.22 μm濾膜過濾，濾液即為EPS樣本。用苯酚-硫酸法測定胞外多糖含量，利用考馬斯亮藍法測定胞外蛋白含量、使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取EPS樣本里的DNA，隨后測定260 nm處的光密度值。

1.3 數據處理

所有實驗重復3次，結果以平均值±標準差標示。采用SPSS 23.0軟件進行差異顯著分析（＜0.05表示差異顯著），制圖采用Origin 2018軟件。

2 結果與分析

2.1 臭氧水、Z21發酵上清液對綠豆芽中大腸桿菌O157:H7的殺菌效果

如表1所示，不同濃度的臭氧水0.1、0.5、1、1.5 mg/L和不同體積分數的Z21發酵上清液2%、4%、6%、8%、10%對綠豆芽中大腸桿菌O157:H7具有殺菌作用。臭氧水和Z21發酵上清液單獨處理10 min時，綠豆芽中大腸桿菌O157:H7的菌落總數減少量分別為0.22～0.97 lg CFU/g、0.19～0.86 lg CFU/g。結果表明，隨著臭氧水濃度和Z21發酵上清液濃度體積分數的增加對大腸桿菌O157:H7殺菌效果顯著提高（＜0.05）；1.5 mg/L 臭氧水和 10% Z21發酵上清液聯合處理時，綠豆芽中大腸桿菌O157:H7的數量減少了2.81 lg CFU/g，結果表明，臭氧水聯合Z21發酵上清液處理比單獨處理顯著降低了綠豆芽中的大腸桿菌O157:H7菌落總數（＜0.05）。

表1 臭氧水、Z21發酵上清液及其聯合處理后綠豆芽中大腸桿菌O157:H7的平均減少量Table 1 Reduction effect of ozone water, Z21 fermented supernatant and their combination on E.coli O157:H7 in mung bean sprouts

聯合處理中的協同效應值均為正數，臭氧水聯合Z21發酵上清液對綠豆芽中大腸桿菌有著協同殺菌作用，這可能是因為臭氧水在制得后0～10 min內，其濃度衰減速度較快，后期Z21發酵上清液殺菌效果強于臭氧水的殺菌效果。如表2所示，在所有的聯合處理中，協同作用值最大為0.98 lg CFU/ g。1.5 mg/L臭氧水與10% Z21發酵上清液聯合處理是降低綠豆芽中大腸桿菌O157:H7菌落總數的最優組合。所以選擇1.5 mg/L臭氧水與10% Z21發酵上清液聯合處理進行接下來殺菌機制的研究。

表2 臭氧水、Z21發酵上清液及其聯合處理后綠豆芽中大腸桿菌O157:H7協同效應Table 2 Synergistic effect of E.coli O157:H7 on mung bean sprouts treated with ozone water, Z21 fermented supernatant and their combined action

2.2 流式細胞儀分析臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7細胞膜通透性的影響

PI能穿透受損細胞的細胞膜與DNA非特異性結合發出紅色熒光，利用PI熒光強度來評價細胞膜的通透性。通過流式細胞計數法計算被PI所染的大腸桿菌O157:H7。如圖2所示，在對照組中，被PI染色的陽性細胞為0.263%，說明對照組中大腸桿菌O157:H7細胞膜完整；經過臭氧水聯合Z21上發酵清液處理后，被PI染色的細胞為83.4%，是對照組的320倍。結果表明，臭氧水聯合Z21發酵上清液處理破壞了大腸桿菌O157:H7細胞膜通透性。

圖2 臭氧水聯合Z21發酵上清液處理對大腸桿菌O157:H7細胞膜通透性的影響Fig.2 Effect of ozone water combined with Z21 fermented supernatant treatment on the cell membrane of E.coli O157:H7

2.3 FT-IR分析臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7細胞結構的影響

圖3為大腸桿菌O157:H7 FT-IR光譜圖，經過臭氧水聯合Z21發酵上清液處理后的大腸桿菌O157:H7細胞壁和細胞膜上大分子蛋白質和脂質的紅外振動峰有明顯的差異。光譜圖中3431 cm處的吸收峰為-OH的伸縮振動引起。在3000～2800 cm之間的波數代表脂肪酸區域，2926、2963 cm為CH和CH的反對稱伸縮振動吸收峰。在1653、1538、1453、1397 cm處與蛋白質、多肽、脂質類特征相對應，1653 cm處屬于酰胺 I帶螺旋，1538 cm處屬于酰胺II帶N-H鍵的彎曲峰。1453 cm附近的吸收帶是由脂質、蛋白質分子中CH的彎曲振動引起，1397 cm附近吸收帶為氨基酸側鏈或游離脂肪酸COO-中C=O對稱伸縮振動所引起。1235、1080 cm的吸收峰發生了明顯的變化，這兩處峰值變化與磷脂、核酸物質＞PO-2中P=O雙鍵的不對稱拉伸振動有關。這些結果進一步說明經過臭氧水聯合Z21發酵上清液處理后的大腸桿菌O157:H7細胞膜和細胞壁中的脂質與蛋白質結構，細胞核酸物質被破壞。

圖3 臭氧水聯合Z21發酵上清液處理前后大腸桿菌O157:H7 FT-IR圖Fig.3 FT-IR spectra of control group and ozone water combined with Z21 fermented supernatant treated samples of E.coli O157:H7

2.4 臭氧水聯合Z21發酵上清液處理前后大腸桿菌O157:H7拉曼光譜圖

圖4為臭氧水聯合Z21發酵上清液處理前后大腸桿菌O157:H7的拉曼光譜圖，在560、802、1095、1520 cm處有明顯的變化；560 cm處拉曼位移代表的多糖中C-O-C特征峰顯著降低，同樣的1095 cm處拉曼位移代表的多糖中C-C、C-O-C鍵伸縮振動特征峰也出現顯著降低；560、1095 cm特征峰揭示了細胞壁和細胞膜中多糖結構的變化。802 cm、1520 cm處拉曼位移分別代表的氨基酸中C-N鍵伸縮振動、酰胺Ⅱ中C-N鍵伸縮振動峰均出現顯著降低，說明臭氧水聯合Z21發酵上清液處理破壞了菌體細胞壁和細胞膜中的蛋白質結構。

圖4 臭氧水聯合Z21發酵上清液處理前后大腸桿菌O157:H7拉曼光譜圖Fig.4 Raman spectra of control group and ozone water combined with Z21 fermented supernatant treated samples of E.coli O157:H7

2.5 臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7菌體形態的影響

通過掃描電鏡觀察臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7菌體形態的影響，如圖5所示，對照組大腸桿菌O157:H7細胞形態完好，細胞未被破壞（圖5A）。與對照組相比，如圖5B所示，經臭氧水聯合Z21發酵上清液處理后細胞形態結構發生變化，部分菌體表面出現褶皺、發生凹陷等變形現象，有些菌體細胞膜受到嚴重破壞，導致菌體破裂。結果表明臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7細胞結構有破壞作用。

圖5 臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7菌體形態的影響Fig.5 Effect of ozone water combined with Z21 fermented supernatant on the morphology of E.coli O157:H7

2.6 臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7生物膜的清除效果研究

2.6.1 臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7生物膜活菌數的影響 如圖6所示，與對照組相比處理后的生物膜中的菌落數發生顯著變化，對照組中大腸桿菌O157:H7活菌數為5.58 lg CFU/cm，蒸餾水處理組大腸桿菌O157:H7活菌數量減少了0.47 lg CFU/cm；臭氧水聯合Z21發酵上清液處理組大腸桿菌O157:H7活菌數量減少了2.19 lg CFU/cm。林琳等研究結果表明，生物膜中活菌數的變化與生物膜的清除效果有關，所以上述結果表明臭氧水聯合Z21發酵上清液處理組對大腸桿菌O157:H7生物膜具有良好的清除效果。

圖6 臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7生物膜活菌數的影響Fig.6 Effect of ozone water combined with Z21 fermented supernatant on E.coli O157:H7 biofilm elimination

2.6.2 臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7生物膜EPS的影響 圖7A為臭氧水聯合Z21發酵上清對大腸桿菌O157:H7生物膜胞外蛋白和多糖含量的影響，對照組中大腸桿菌O157:H7生物膜胞外蛋白含量為 38.75 μg/mL，胞外多糖含量為23.93 μg/mL。經處理后，大腸桿菌O157:H7的胞外多糖和蛋白含量顯著降低（＜0.05）。臭氧水聯合Z21發酵上清液處理后的胞外多糖和胞外蛋白含量顯著低于蒸餾水處理組（＜0.05）。圖7B為臭氧水聯合Z21發酵上清對大腸桿菌O157:H7生物膜胞外DNA的影響，經臭氧水聯合Z21發酵上清液處理后的胞外DNA顯著低于蒸餾水處理組（＜0.05）。在生物膜形成過程中，細菌會產生EPS，可以保護細菌免受不利環境的影響，因此生物膜EPS的破壞不利于生物膜內細菌的生存。臭氧水聯合Z21發酵上清液處理降低了胞外多糖、蛋白、DNA的含量，破壞了大腸桿菌O157:H7生物膜的結構。

圖7 臭氧水聯合Z21發酵上清對大腸桿菌O157:H7生物膜EPS的影響Fig.7 Effect of ozone water combined with Z21 fermented supernatant on the EPS of E.coli O157:H7 biofilm

3 結論

實驗結果表明，1.5 mg/mL濃度的臭氧水聯合10% Z21發酵上清液處理10 min可以有效降低綠豆芽中大腸桿菌O157:H7的菌落總數。通過流式分析技術發現臭氧水聯合Z21上清液處理后PI染色細胞增加，說明臭氧水聯合Z21發酵上清液處理增加了大腸桿菌O157:H7細胞膜的通透性；結合傅里葉紅外光譜和拉曼光譜分析充分證明臭氧水聯合Z21上清液處理破壞了細胞壁和細胞膜結構，從而達到殺菌作用。臭氧水聯合Z21發酵上清液對大腸桿菌O157:H7生物膜具有良好清除效果，胞外聚合物中多糖、蛋白、DNA含量均顯著減少（＜0.05）。因此，臭氧水聯合Z21發酵上清液處理對大腸桿菌生物膜的清除及農產品防腐保鮮提供了理論依據。