枯草芽孢桿菌拮抗菌的篩選鑒定及其抑菌特性研究

郭麗丹，張曉妍，周婉婷，張秀勤，陳雨瀅，楊梓璐，汪立平,2,3,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；

2.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306；3.上海海洋大學食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306）

枯草芽孢桿菌（）是一種革蘭氏陽性菌，具有極強的抗逆性，一般的巴氏殺菌難以將其完全殺死。它作為一種常見的食品腐敗菌，可以引起食品的腐敗變質，進而導致一些食源性疾病，甚至會造成食物中毒。現有的應用于食品防腐領域的化學防腐劑，有著很大的潛在風險，國家食品防腐劑標準（GB 2760-2014）也對其使用進行了嚴格的限制，這進一步增加了食品防腐的難度。天然的生物防腐劑作為一種安全、高效的新型防腐劑，其相關研究已成為食品工業的一個研究熱點。

現有研究表明，生存于特殊生態環境的乳酸菌能夠分泌具有廣譜抑菌性的抗菌肽，它是一種具有抗菌活性的小分子多肽類物質，其對常見腐敗菌和病原菌均具有明顯的抑制作用，且多具有良好的熱穩定性，不會對人體造成危害，不易導致耐藥性。目前，廣泛應用的乳酸菌抗菌肽為乳酸鏈球菌素（Nisin），其已被50多個國家允許添加到食品當中，并且其也是唯一被美國食品藥品監督管理局認可的抗菌肽。近年來，雖然國內外對于乳酸菌抗菌肽的研究眾多，但鮮有研究關注于其對枯草芽孢桿菌的抑制作用，并且隨著由枯草芽孢桿菌引起的食品污染事件的日漸增加，開發出一種對枯草芽孢桿菌具有抑制作用的新型抗菌肽就顯得尤為重要。

產抗菌肽乳酸菌主要來自發酵食品、胃腸道、海洋、土壤等，其中發酵泡菜富含大量乳酸菌，可以保持長時間不變質，乳酸菌產的抗菌肽起到了相當大的作用。本研究以各地泡菜為原料，篩選出一株對枯草芽孢桿菌有強烈抑制作用的產抗菌肽乳酸菌，采用乙酸乙酯萃取法得到抗菌肽粗提物，并對其進行了抑菌特性的研究。本實驗為該乳酸菌菌株的開發利用和該抗菌肽后續的深入研究與應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

農家自制泡菜樣品 取自山東、上海、四川眉山、安徽、武漢、云南等地區；韓村天和腌制蘿卜樣品 山東威海；春順醬腌菜 山東青島；樂江金友邦酸菜 四川成都；巧媳婦腌制蘿卜菜 四川眉山；蜀大娘腌制蘿卜菜 四川綿陽；如意島泡菜 遼寧鐵嶺，樣品貯藏于4℃冰箱備用。

枯草芽胞桿菌（strain B39） 鎮沅松子地綠色食品有限公司的脹袋泡菜樣品分離所得；MRS肉湯干粉培養基 HKM；胰蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸氫二鉀等培養基成分和無水碳酸鈣 國藥集團；溶菌酶（≥2000 U/mg）、溴化乙啶（EB）、TAE 緩沖液、瓊脂糖、Ezup柱式細菌基因組 DNA 抽提試劑盒、PCR相關試劑 上海生工；BCA蛋白濃度試劑盒北京索萊寶；革蘭氏染色試劑盒 比克曼生物。

7200型紫外可見分光光度計 UNIC；A300型梯度PCR儀 LongGene；H2050R臺式真空冷凍離心機 湖南湘儀；RV8V旋轉蒸發儀 IKA；JY-SCZ2+電泳儀 北京君意東方；Gel Doc凝膠成像系統BIO-RAD；UV-6100紫外全波長掃描儀 上海美譜達儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 產抗菌肽乳酸菌的篩選

1.2.1.1 菌株初篩 使用無菌生理鹽水對泡菜樣品進行梯度稀釋，制成10、10和10菌懸液，各取100 μL注入含2%碳酸鈣的MRS培養基無菌板中，搖勻后，置于37 ℃恒溫培養箱培養48 h。然后，對產生溶鈣圈的菌株進行多次篩選和純化，選取單菌落接種到10 mL MRS液體培養基中，置于搖床中培養（37 ℃, 150 r/min, 24 h），得到種子液。種子液以2%接種量接入MRS液體培養基中，上述條件培養后得發酵液。將發酵液進行離心（8000 r/min, 4 ℃,15 min）獲得上清液，使用0.22 μm的水濾膜對上清液進行過濾，獲得無細胞發酵上清液（Cell free supernatants，CFS）備用。

1.2.1.2 菌株復篩 由于CFS中含有機酸、過氧化氫、抗菌肽等抑菌物質，可能對初篩結果造成影響，因此該研究通過排除有機酸、過氧化氫的影響來進行復篩。首先，將CFS等分為3份，一份不做任何處理；一份用NaOH調節pH至6.5，以排除有機酸的影響；一份在排除有機酸后，加入過氧化氫酶，調節pH至7.5，37 ℃恒溫水浴4 h后，將pH調回6.5，以排除過氧化氫的影響。將三份CFS溶液置于4 ℃保存過夜，備用。

本實驗采用雙層瓊脂擴散法進行復篩。首先，將枯草芽胞桿菌接種于LB培養基中，置于搖床（37 ℃, 150 r/min）中培養 12 h，獲得 10CFU/mL 指示菌菌懸液；然后，向50 ℃，含0.75% 瓊脂的LB培養基中加入1%（v/v）的指示菌菌懸液，將兩者混勻后倒在素瓊脂上，待培養基凝固后，使用打孔器均勻打下直徑7 mm的圓孔，向每孔注入50 μL上述處理過的3種CFS溶液，在4 ℃條件下擴散2 h后，置于恒溫培養箱（37 ℃）培養12 h。培養結束后，觀察是否產生抑菌圈，并用游標卡尺測量抑菌圈大小。每組實驗重復三次。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態學鑒定 采用平板劃線法在MRS固體平板上多次純化菌株，并觀察其菌落形態，根據單菌落形態特征進行初步判斷后，對其進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察并記錄其染色情況和菌體形態。

1.2.2.2 生理生化特征 根據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》方法，采用吲哚實驗，過氧化氫實驗、產酸產氣、有無鞭毛以及碳水化合物發酵實驗等對 1.2.1.2 抑菌實驗中抑菌圈最大的乳酸菌菌株，進行生理生化鑒定。

1.2.2.3 分子生物學鑒定 基因組DNA提取：取1 mL菌液置于1.5 mL離心管中，按試劑盒的操作步驟提取總DNA。以總DNA作為模板，以27F（5'-A GAGAGTTTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTAC TTGTTACG ATT-3'）為引物進行PCR擴增。PCR擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃1 min，共 35 個循環，總體系為 25 μL。將瓊脂糖凝膠電泳膠條放入EB染色液中染色20 min，觀察電泳條帶，最后將擴增后的產物送至上海生工進行測序。

16S rDNA序列分析：首先在NCBI使用BLAST對測序結果進行分析，找到同源性近的模式菌株序列；然后使用MAGE-X軟件進行系統發育樹的構建。最后，向GenBank數據庫提交菌株的16S rDNA序列，獲得登錄號。

1.2.3 抗菌肽的粗提方法研究 抗菌肽常以微量級別存在于野生環境當中，粗提方法的選擇和濃縮是純化抗菌肽的關鍵。本研究以strain B39（10CFU/mL）為指示菌，采用1.2.1.2中的雙層瓊脂擴散法測定抑菌效果。以篩選出的菌株的CFS溶液500 mL作為原料進行抗菌肽的粗提，濃縮40倍后，探究了有機溶劑萃取法、硫酸銨沉淀法等方法的粗提效果。

1.2.3.1 有機溶劑萃取法 根據相似相容原理，使用乙酸乙酯、正丁醇對CFS進行萃取，以得到抗菌肽粗提取物。首先，兩種有機溶劑分別與CFS溶液按1:1的比例充分混合后，提取有機相溶液，然后在真空旋轉蒸發儀除去有機溶劑，保留沉淀。用 5 mmol/L PBS（pH6）重懸，最終體積濃縮40倍，獲得抗菌肽粗提物溶液，置于4 ℃下，備用。

1.2.3.2 醇沉水提法 采用醇沉水提法提取抗菌肽。首先，將CFS在真空旋轉蒸發儀（45 ℃）中濃縮10倍，向濃縮液中加入95%無水乙醇并攪拌均勻，保證最終溶液中無水乙醇的濃度為75%，然后在4 ℃ 下醇沉 12 h。最后，離心（4 ℃, 8000 r/min, 10 min）保留上清液，并在45 ℃條件下旋蒸濃縮4倍獲得抗菌肽粗提物溶液，置于4 ℃下，備用。

1.2.3.3 硫酸銨沉淀法 根據4 ℃下硫酸銨飽和度表，向CFS中添加硫酸銨粉末至飽和度為60%、70%、80%、90%、100%。冰水浴攪拌溶解后，在4 ℃條件下，攪拌過夜。然后，離心（8000 r/min, 30 min）收集沉淀，向沉淀中加入5 mmol/L PBS（pH6），濃縮40倍，獲得抗菌肽粗提物。

1.2.4 抗菌肽的特性研究

1.2.4.1 全波長掃描 使用BCA蛋白定量試劑盒測定抗菌肽溶液濃度，然后用無菌蒸餾水配制0.5 mg/mL經乙酸乙酯萃取的抗菌肽粗提物溶液，于200～800 nm波長范圍內對其進行紫外光譜掃描分析。

1.2.4.2 抗菌肽產量與菌體生長的關系 將所得菌株按接種量2%（v/v）接種于MRS培養基，在37 ℃、150 r/min下培養24 h，每2 h取一次樣，通過記錄OD值，完成菌株生長曲線的繪制，同時記錄pH的變化。使用strain B39作為指示菌，采用1.2.1.2中的雙層瓊脂擴散法檢測各階段抑菌效果，并繪制抑菌活性曲線。通過繪制菌體生長曲線與抑菌活性曲線，評價抗菌肽的產量與菌株生長的關系。

1.2.4.3 MIC的測定 采用二倍稀釋法測定抗菌肽對枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度（The minimum inhibitory concentration, MIC）。MIC 具體的測定方法如下：首先，將512 μg/mL純化的抗菌肽溶液用超純水進行連續2倍稀釋，以獲得不同濃度的稀釋液。然后，分別吸取不同濃度的稀釋液50 μL等體積添加到含strain B39懸浮液（10CFU/mL）的96孔板中，37 ℃下培養12 h。具有最小抑菌效果的稀釋液所對應的濃度即為最小抑菌濃度MIC。

1.2.4.4 時間殺菌曲線的繪制 將抗菌肽加入到strain B39懸浮液的對數中期（OD=0.6）溶液中，獲得濃度為3 MIC的溶液, 以不加入抗菌肽的樣品作為空白對照。將含有抗菌肽的菌懸液在37 °C下培養12 h，每小時取一次樣，使用紫外-可見分光光度計在600 nm處記錄菌體生長的變化，同時進行平板菌落活菌計數（CFU/mL），樣品用無菌生理鹽水稀釋后，涂布PCA瓊脂板上，于37 ℃下培養12 h，觀察并統計活菌數。

1.3 數據處理

以上所測數據均設置3個平行，以平均值±標準差方式呈現。利用SPSS 25.0統計軟件分別對數據進行處理與分析，Origin 9.0 軟件繪制主成分圖譜。

2 結果與分析

2.1 產抗菌肽乳酸菌的篩選

本研究共從泡菜樣品中分離得到168株菌株，在經過篩選后，有8株菌株對枯草芽胞桿菌表現出明顯的抑制效果，不同菌株的抑制效果如表1所示。在排除有機酸的影響后，抑菌圈均有些許的減小，但仍具有顯著的抑菌活性。去除過氧化氫后，發酵液抑菌直徑沒有明顯變化。其中，WUH3具有最強的抑制效果，CFS抑菌圈直徑最大，在排除有機酸和過氧化氫的影響后，抑菌效果仍明顯，抑菌直徑可達25.13±0.10 mm。故選取WUH3作為目的菌株，進行后續試驗。

表1 優勢菌對枯草芽胞桿菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of dominant bacteria on B.subtilis strain B39

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態學鑒定 在 MRS 固體培養基上用劃線稀釋法分離乳酸菌菌株。將接種后的培養基置于37 ℃培養箱內培養48 h，觀察培養基表面形成的乳酸菌的形態，其結果如圖1所示，菌落顏色為白色，形狀為圓形，邊緣為全緣，凸起，菌落直徑在1～2 mm范圍內。

圖1 WUH3的形態學特征Fig.1 Morphological features of WUH3

2.2.2 生理生化特征 對菌株WUH3 進行生理生化實驗鑒定，結果見表2。該菌株過氧化氫實驗陰性、吲哚陰性、不產氣、無鞭毛、不運動、不液化明膠、不還原硝酸鹽；可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、乳糖和木糖。將鑒定結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中對乳桿菌的生理生化實驗鑒定結果相對比，可初步鑒定所分離的菌株WUH3為乳桿菌屬。

表2 菌株WUH3生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain WUH3

2.2.3 分子生物學鑒定 如圖2所示，WUH3的PCR擴增產物在1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳中于1000～2000 bp處形成1條清晰的擴增條帶。以乳桿菌屬（spp.）中的模式菌株為參考菌，采用MAGE-X軟件構建WUH3的系統發育樹（圖3）。根據構建的系統發育樹，WUH3與植物乳桿菌（）在同一分支，同時與戊糖乳桿菌（）親緣關系最近, 其次為植物乳桿菌阿根廷亞種（subsp.）。

圖2 菌株WUH316S rRNA基因的PCR檢測結果Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR products of strain WUH3 16S rRNA gene

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的WUH3系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of WUH3 based on 16S rRNA gene sequence

通過菌落形態觀察、分子生物學鑒定和系統發育樹分析，表明菌株WUH3為，已獲得其GeneBank數據庫登錄號為MZ751052.1。

2.3 抗菌肽的粗提方法研究

為了濃縮并最大程度地保留WUH3 CFS中抑菌物質的活性，本研究探索了不同的粗提方法。以strain B39為指示菌研究不同方法的粗提效果，其結果如表3所示。由表可知，乙酸乙酯的萃取效果最好，水相中僅有少部分抑菌活性物質殘留，乙醇和正丁醇萃取過程中，抑菌物質活性損失較大，且有機相中保留的活性較低。在飽和硫酸銨沉淀實驗中，濃度為70%和80%時沉淀效果最好，但還有一大部分抑菌物質殘留在上清液中，未被提取出來。綜合對比，抑菌物質提取率最大的是有機溶劑乙酸乙酯萃取法，其最大程度地保留了抑菌物質的活性，故本實驗選擇乙酸乙酯萃取作為后續實驗抗菌肽的粗提方法。

表3 不同粗提方法處理CFS后保留的抑菌活性Table 3 Reserved antibacterial activity of CFS treated by different crude extraction methods

2.4 抗菌肽的特性研究

2.4.1 全波長掃描 BCA蛋白濃度標曲為y=1.5314-0.0032，=0.9996。對粗提得到的抗菌肽進行紫外全波長掃描，其結果如圖4所示。WUH3所產抗菌肽在280 nm附近有單的強吸收峰，這是肽鍵在遠紫外區特有的吸收特征。進一步蛋白酶敏感實驗結果表明，在經蛋白酶處理過后，粗提物抑菌活性消失，說明該抑菌物質具有蛋白類物質的特性，故證明所得抗菌肽為一種蛋白或多肽類物質。

圖4 L.plantarum WUH3所產抗菌肽粗提物的紫外全波長掃描圖Fig.4 Ultraviolet full wavelength scanning of crude extracted AMP produced by L.plantarum WUH3

2.4.2 抗菌肽產量與菌體生長的關系 為確定WUH3生長過程中抗菌肽產量的變化，連續24 h監測菌體在MRS培養基中的吸光度值、pH和抗菌肽的抑菌活性。由圖5可知，WUH3菌體在第6 h開始產生抗菌肽，之后，隨時間的增加，其抑菌活性不斷增加，在第18 h抑菌活性開始保持平穩。此時，通過OD監測得知，菌體的生長進入了穩定期。在菌體生長期間，整個菌體發酵液的pH不斷地下降，證明WUH3在生長過程中會不斷產生酸類物質直至穩定期。該結果表明，在菌體生長達到穩定期時，為抗菌肽的最佳收獲時期。

圖5 L.plantarum WUH3的抗菌肽產量與菌株生長時間的相關性Fig.5 Correlation between the yield of AMP and the growth time of L.plantarum WUH3

2.4.3 MIC MIC是評價抑菌物質抑菌能力的一個重要指標。本實驗通過二倍稀釋法測定了所得抗菌肽的MIC值。將抗菌肽溶液進行連續的2倍稀釋后，使用稀釋液進行抑菌實驗，結果如圖6所示，連續稀釋5次后，抑菌效果依然明顯，OD均為0。在大于5次的稀釋倍數下，抗菌肽抑制效果減弱，指示菌strain B39濁度逐漸增加。通過BCA蛋白濃度試劑盒測定其MIC蛋白濃度為16 μg/mL。

圖6 不同濃度的抗菌肽對B.subtilis strain B39的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of the AMP with different concentrations on B.subtilis strain B39

2.4.4 時間殺菌曲線 抗菌肽作用方式通常包括抑菌和殺菌兩種，為探究WUH3所產抗菌肽的作用機制，向枯草芽胞桿菌生長對數期培養液中加入抗菌肽，獲得終濃度為 48 μg/mL（3 MIC）的混合溶液，以未添加抗菌肽培養液作為對照，分別測定兩者的OD，并進行平板菌落活菌計數，其結果如圖7所示。在strain B39生長至第3.5 h時加入抗菌肽，與對照組相比，可以明顯觀察到加入抗菌肽后，溶液的吸光度不再發生變化。通過菌體平板計數結果發現，加入抗菌肽后，活菌數驟減，且在第9 h時，在PCA計數板上已經觀察不到任何strain B39菌體的生長。以上結果表明，該抗菌肽的作用方式為殺菌。

圖7 時間殺菌曲線Fig.7 Time-killing curve

3 結論

乳酸菌作為一種公認的食品安全菌，其所生產的抗菌肽的抑菌能力得到了廣泛的認可。本研究以農家泡菜樣品作為原料，在排除有機酸和過氧化氫的影響后，采用雙層瓊脂擴散法篩選出1株對枯草芽胞桿菌有明顯抗菌作用的乳酸菌菌株——WUH3。試驗發現使用乙酸乙酯進行萃取可以獲得最好的抗菌肽粗提效果，紫外全波長掃描結果顯示該物質肽類特征吸收峰顯著，其在菌體生長達到穩定期（18～24 h）時達到最大產量。進一步的研究表明，該抗菌肽的最小抑菌濃度MIC為16 μg/mL，且其在3 MIC條件下，對枯草芽孢桿菌具有殺菌作用。

綜上所述，WUH3對常見腐敗菌——枯草芽胞桿菌具有明顯的抑制效果，具有成為新型的天然防腐劑的潛在價值。本試驗研究了使用乳酸菌抗菌肽進行抑菌，為摒棄傳統化學防腐劑抑菌方法，開發抑制枯草芽胞桿菌的新型防腐劑提供了一定的參考價值。