酶法制備玉米皮膳食纖維的工藝優化及其功能性研究

汪 睿，姜彩霞，劉曉蘭 ，鄭喜群,,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；

2.黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術中心，黑龍江大慶 163319；

3.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；4.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

隨著食品工業的不斷發展，越來越多的精加工食品成為了人們飲食的主流產品。但攝入過多的精加工食品會導致部分營養物質的流失，同時也增加了肥胖癥、高血壓與高血脂的患病幾率。糖類、脂肪及膽固醇會因膳食纖維的阻礙而降低其吸收率和利用率因此可以輔助控制餐后血糖，同時膳食纖維還可以降低脂類的消化，提高飽腹感，能夠有效抑制肥胖癥、高血脂和慢性腸道疾病等。2000年中國營養學會中提出，平均我國每人每天應攝入膳食纖維30 g左右，而實際我國人均攝入量僅為18.5 g。因此膳食纖維的開發對我國居民營養具有十分重要的意義。

在糧食作物中玉米的世界總產量最高，作為玉米加工的主要副產物之一的玉米皮占玉米總量的14%～20%，通常用于動物飼料。玉米皮主要由不溶性纖維、纖維素、半纖維素、低聚木糖、油脂、水分、淀粉及蛋白質組成，其中膳食纖維的含量約為總量的60%～70%，可作為膳食纖維的良好來源。通過擴大玉米皮的使用范圍，并將其轉化為增值產品具有重要的社會價值和市場前景。目前膳食纖維的制備方式大體分為三種，分別是化學法、物理法以及酶法。相較于其他兩種制備方式，酶法制備具有條件溫和、可控性強以及成本適中的特點。

本文采用酶法制備玉米皮膳食纖維，通過單因素實驗和響應面優化確定最佳的制備工藝，并通過體外試驗測定了其持水性、吸水膨脹性、膽固醇吸附性、持油性、葡萄糖吸附性以及對脂肪消化模型的影響，為玉米皮膳食纖維作為預防肥胖的功能性成分提供了理論依據，并對提高玉米皮的附加值，促進其綜合利用起到了積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米皮 北京糧食集團有限責任公司；大豆油、玉米油、菜籽油、豬油 均從當地市場采購；堿性蛋白酶（2×10U/g） 南寧龐博生物有限公司；糖化酶（1.5×10U/g）、淀粉酶（2×10U/g） 天津諾奧科技有限公司；豬膽汁提取物、脂肪酶來自豬胰腺sigma-aldrich（上海）貿易有限公司；淀粉含量檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑等均為分析純。

K9860全自動凱氏定氮儀 海能儀器（上海）有限公司；TGL-16M離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV-2501PC紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DF-101智能磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米皮主要營養成分的測定

1.2.1.1 水分含量測定 采用快速水分測量法，稱取1 g玉米皮于錫紙托盤上，放入水分測定儀中，設置溫度110 ℃，時長10 min后讀數。

1.2.1.2 灰分含量測定 參照國標方法GB 5009.4-2016，準確稱取玉米皮2 g于坩堝中，放入馬弗爐550 ℃灼燒4 h，取出后稱重。

1.2.1.3 蛋白質含量測定 采用凱氏定氮法GB 5009.5-2016測定蛋白質殘留量，稱取樣品1 g加入2.5 g催化劑（硫酸鉀與硫酸銅15:1混合），倒入10 mL濃硫酸進行消化，消化完成將消化管放入全自動凱氏定氮儀記錄數據。

1.2.1.4 淀粉含量測定 采用索萊寶淀粉試劑盒進行測定，稱取0.1 g樣品加0.8 mL蒸餾水勻漿，放置提取15 min，室溫下4000 r/min離心10 min，取上清液在540 nm處測量吸光度。

1.2.1.5 膳食纖維含量測定 參照國標方法GB 5009.88-2014，稱取1 g樣品用堿性蛋白酶（300 U/mL）和-淀粉酶（10000 U/mL）分別酶解 30 min，4000 r/min離心 15 min，將沉淀用 70 ℃蒸餾水沖洗 2次，用78%乙醇、95%乙醇以及丙酮分別沖洗2次后，烘干過夜后稱重，減去灰分與蛋白質即為不溶性膳食纖維含量。將離心后的上清液用4倍體積乙醇進行沉淀，收集沉淀將沉淀用78%乙醇、95%乙醇以及丙酮分別沖洗2次后，烘干過夜后稱重，減去灰分與蛋白質即為可溶性膳食纖維含量。可溶性膳食纖維含量與不溶性膳食纖維含量之和即為總膳食纖維含量。文中若未強調可溶性均為總膳食纖維。

1.2.2 玉米皮膳食纖維的制備 參照Zheng等的方法，略做改動。玉米皮原料粉碎，過60目篩。采用兩步酶解工藝，分別為蛋白酶酶解和淀粉復合酶（中溫-淀粉酶與糖化酶，m/m=1:1）酶解，首先進行堿性蛋白酶水解，酶解后取出進行沸水浴滅酶，滅酶時間20 min，然后進行淀粉復合酶水解，對酶解液進行高溫滅酶20 min后4000 r/min離心15 min，沉淀用4倍體積的95%乙醇進行醇洗，45 ℃真空干燥48 h得玉米皮膳食纖維。

1.2.3 單因素實驗 酶法提取玉米皮膳食纖維可分為蛋白質的水解與淀粉的水解兩步，因此圍繞蛋白質水解和淀粉水解進行單因素實驗設計，以達到提高最終產物中膳食纖維含量目的。

1.2.3.1 蛋白質水解單因素實驗 以堿性蛋白酶添加量0.7%，酶解pH為9，酶解溫度52 ℃，酶解時間3 h為固定條件，考察堿性蛋白酶添加量（0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%）、酶解 pH（8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）、酶解溫度（48、50、52、54、56 ℃）、酶解時間（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）對蛋白質殘留量的影響。

1.2.3.2 淀粉水解單因素實驗 以淀粉復合酶添加量0.8%，酶解pH為6.5，酶解溫度65 ℃，酶解時間2 h為固定條件探究淀粉復合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、酶解 pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、酶解溫度（50、55、60、65、70 ℃）、酶解時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對淀粉殘留量的影響。

1.2.4 響應面試驗 為達到提高最終產物膳食纖維含量的目的，在單因素實驗的基礎上，從蛋白酶水解單因素中選擇蛋白酶添加量與蛋白酶解時間，兩個對蛋白質殘留量波動影響較大的指標作為因素A、因素B，從復合淀粉酶單因素中選擇復合酶添加量與復合酶酶解pH，兩個對淀粉殘留量波動影響較大的指標作為因素C、因素D，以膳食纖維含量作為響應值Y，進行響應面試驗設計及優化，因素水平表見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 玉米皮膳食纖維理化功能特性分析

1.2.5.1 持水性的測定 參照López-marcos等的方法，略有修改。稱取適量樣品，放入50 mL離心管中加水配制成濃度為5%的溶液，混合均勻，在室溫下靜置4 h后，經4000 r/min離心15 min，稱量離心后沉淀物重量，計算持水性公式如下：

式中：m為樣品濕重（g）；m 為樣品干重（g）。

1.2.5.2 膨脹性的測定 參照何曉琴等的方法，略有修改。稱取樣品1 g，置于20 mL量筒中，加入10 mL蒸餾水充分混勻，在25 ℃下靜置18 h，膨脹性計算公式如下：

式中：v為初始樣品體積（mL）；v為水合樣品體積（mL）；m 為樣品干質量（g）。

1.2.5.3 持油性的測定 參照湯小明等的方法，略有改動。稱取適量樣品，放入50 mL離心管中，加入適量食用油（樣品與食用油質量比為1:8），使用大豆油、玉米油、菜籽油與豬油進行對照試驗，混合均勻，在室溫下靜置4 h后，經4000 r/min離心15 min，稱量離心后沉淀物重量，計算持油性公式如下：

式中：m為樣品濕重（g）；m 為樣品干重（g）。

1.2.5.4 葡萄糖吸附性的測定 參照劉倩等的方法，略加改動。稱取1 g樣品與100 mL的葡萄糖標準溶液（50 mmoL/L）混勻，置于37 ℃水浴中180 r/min攪拌吸附4 h，離心取上清液，利用DNS法測定上清液中葡萄糖的含量，葡萄糖吸附性計算公式如下：

式中：m為樣品干重（g）；n為吸附前溶液中葡萄糖含量（mmoL）；n為吸附后溶液中葡萄糖含量（mmoL）。

1.2.5.5 膽固醇吸附性的測定 參照王紅等的方法，略改動。取雞蛋蛋黃加水配制成10%蛋黃稀釋液，取30 mL蛋黃稀釋溶液于燒杯中，用1 mol/L HCl將溶液 pH調至2.0（模擬胃環境）、0.1 mol/L NaOH將溶液pH調整為7.0（模擬小腸環境），分別加入1 g樣品 37 ℃水浴振蕩 2 h，4000 r/min離心15 min，吸取1 mL上清液在波長550 nm處測定吸光值，膽固醇吸附能力計算公式如下：

式中：m為樣品干重（g）；n吸附前蛋黃溶液吸光度帶入膽固醇標準曲線后所得膽固醇含量（mg）；n吸附后蛋黃溶液吸光度帶入膽固醇標準曲線后所得膽固醇含量（mg）。

1.2.5.6 膳食纖維對體外脂肪消化模型的影響 參照Yang等的方法，略改動。取500 mg樣品加30 mL水油混合液（含0.5%玉米油，經高速分散均質處理）37 ℃攪拌30 min。另取3.5 mL膽汁鹽溶液（187.5 mg膽汁提取物溶解在3.5 mL PBS緩沖溶液中，pH7.0）和1.5 mL鹽溶液（55 mg氯化鈣和328.7 mg氯化鈉溶于1.5 mL PBS緩沖溶液中，pH7.0）加入到樣品混合物中，37 ℃攪拌，調節pH至7.0。再向上述混合物中加入2.5 mL新鮮配制的脂肪酶懸液（60 mg脂肪酶粉分散在2.5 mL PBS緩沖溶液中，pH7.0），分別在 5、15、30、60、90、120 min時添加 NaOH（0.1 mol/L），通過測量 NaOH（0.1 mol/L）的體積來監測釋放的游離脂肪酸（FFAs），以不含膳食纖維樣品作為對照，計算公式如下：

式中：C為NaOH溶液濃度（mol/L）；V為中和釋放的游離脂肪酸所需的NaOH溶液滴定體積（mL）；MW 為玉米油的平均分子量（872 g/mol）；M為玉米油的初始質量（g）；2為假定所有三酰甘油都水解成兩分子游離脂肪酸和一分子單酰甘油。

1.3 數據處理

根據 Box-Benhnken的試驗設計原理，通過SPSS軟件對數據進行處理與回歸分析，并進行三次重復實驗。

2 結果與分析

2.1 玉米皮主要成分分析

如表2所示玉米皮中蛋白質含量為8.53%，膳食纖維含量為65.34%，可知玉米皮中富含大量膳食纖維，若充分利用可大幅度提高玉米皮的潛在價值，并且可以為玉米皮的綜合開發利用提供廣闊的市場和發展前景。

表2 玉米皮主要成分含量Table 2 Content of main components in corn bran

2.2 玉米皮膳食纖維提取單因素實驗

2.2.1 蛋白酶酶解條件對玉米皮中蛋白質殘留量的影響 有研究發現，玉米皮中蛋白質以網狀結構包裹部分淀粉顆粒，優先去除蛋白質組分更有利于玉米皮中淀粉組分的去除。由圖1可知，隨堿性蛋白酶添加量的增大，蛋白質殘留量逐漸降低，當酶添加量到達0.7%時蛋白質殘留量為3.14%，繼續增大酶添加量，蛋白質殘留量變化并不明顯，這是由于定量的底物隨酶添加量的增加逐漸達到飽和，并且酶添加量過多也會出現酶與酶之間相互抱團無法與底物充分接觸。pH與蛋白質殘留量成反比關系，當pH為10時蛋白質殘留量2.97%，而后pH繼續升高蛋白質殘留量會略微回升，這種現象可能是由于越接近最適pH酶活性越高，因此蛋白質殘留量逐漸下降，而發生回升現象的原因是由于pH過高導致堿性蛋白酶活性降低，從而影響到蛋白質的去除效果。蛋白質殘留量隨溫度的升高而降低，當溫度達到54 ℃時蛋白質殘留量達到最低值，最低值為3.21%，溫度繼續升高蛋白質殘留量也會升高，出現這種現象可能的原因首先是通過升高溫度使得酶活性逐步提高，而后繼續升溫，過高的溫度抑制了堿性蛋白酶的活性，從而導致蛋白水解效果降低。酶解時間對蛋白水解影響較大，隨時間增長蛋白質殘留量逐漸下降，接近3.5 h隨時間的增長蛋白含量下降趨勢逐漸變緩，這可能是由于定量的底物隨酶解時間增加逐漸被完全水解，底物不斷變稀導致酶無法與底物充分結合從而減緩酶解效率。經單因素實驗不難發現溫度與pH在經過最適條件后均出現回升，因此溫度與pH采用最適條件，添加量（0.6%、0.7%、0.8%）與時間（3、3.5、4 h）進行進一步優化。

圖1 蛋白酶酶解條件對玉米皮膳食纖維中蛋白質殘留量的影響Fig.1 Effect of protease hydrolysis conditions on the protein residue in corn husk dietary fiber

2.2.2 淀粉復合酶酶解條件對玉米皮中淀粉殘留量的影響 由圖2可知，以膳食纖維中淀粉殘留量為指標，當添加量超過0.8%，隨添加量升高，酶解效果提升并不顯著，這可能是因為底物與酶的比例逐漸達到飽和。pH對淀粉殘留量影響較大，隨pH升高淀粉殘留量大幅度下降，當pH高于6.5時淀粉殘留量變化趨勢逐漸變緩，這可能是因為酶活性中心基團的解離程度逐漸變緩導致趨勢變緩。隨著溫度的升高淀粉殘留量在逐步減少，在65 ℃時達到最小值，其含量為0.58%，溫度繼續升高，淀粉殘留量上升，這是由于溫度過高抑制了復合酶活性。淀粉殘留量隨時間增加而減小，但2 h后隨酶解時間增加淀粉殘留量變化并不明顯，這可能是由于酶解反應中底物濃度減小，減緩了酶解速率。經單因素實驗可以看出溫度在超過最適值后淀粉殘留量出現回升因此將溫度選擇在最適條件65 ℃，時間在2 h后淀粉殘留量下降僅為0.01%左右并且時間對淀粉殘留量影響較小，因此將酶解時間確定為2 h。由于添加量與pH對淀粉殘留量影響波動較大，因此進行進一步優化，添加量選擇0.7%、0.8%、0.9%，pH選擇6、6.5、7。

圖2 淀粉復合酶酶解條件對玉米皮膳食纖維中淀粉殘留量的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis conditions of starch complex enzymes on starch residue in corn bran dietary fiber

2.3 玉米皮膳食纖維提取工藝回歸模型的建立及方差分析

由上述實驗表明，因素A（蛋白酶添加量）與因素B（蛋白酶酶解時間）對蛋白質殘留量波動影響較大，因素C（淀粉復合酶添加量）與因素D（淀粉復合酶酶解pH）對淀粉殘留量波動影響較大，且根據李晶試驗可知蛋白殘留量與淀粉殘留量的降低會直接影響到最終產物中膳食纖維的含量。因此本試驗用響應面進行優化，以A（蛋白酶添加量）、B（蛋白酶酶解時間）、C（淀粉復合酶添加量）、D（淀粉復合酶酶解pH）四個主要影響因素作為自變量，以玉米皮膳食纖維含量為響應值Y，采用Box-Behnken試驗設計原理對其工藝參數進行優化，結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Response surface test design and results

對表3中數據進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程 Y=85.67+0.31×A+0.66×B+0.25×C+0.73×D-0.46×AB-1.00×AC+0.34×AD-1.44×BC+1.44×BD-0.46×CD-1.30×A-1.58×B-1.57×C-0.87×D。

由表4可知，所建立的模型極顯著（=40.19，＜0.0001），失擬項差異不顯著（0.0928＞0.05），這表明方程對試驗擬合程度較高，回歸系數為0.9760，校正決定系數為0.9519，說明95.19%的響應值變化都可以用該模型解答。因此該模型對玉米皮膳食纖維得率進行分析和預測是可靠的。對回歸方程顯著性檢驗，結果表明A（蛋白酶添加量）、B（蛋白酶酶解時間）、D（淀粉復合酶酶解pH）對玉米皮膳食纖維含量影響極顯著（＜0.01）；C（淀粉復合酶添加量）對玉米皮膳食纖維含量影響顯著（＜0.05），交互作用下自變量之間均會相互影響，并且二次項均極顯著（＜0.0001）。該模型對玉米皮膳食纖維含量進行分析和預測是可靠的。

表4 回歸方程方差分析及結果Table 4 Analysis of variance of regression equation and results

2.4 響應面分析

圖3顯示了響應值隨著各因素水平的增加而增加，達到最高點后，響應值開始逐漸減小。其中玉米皮膳食纖維的提取中AC（蛋白酶添加量和淀粉復合酶添加量）、BC（蛋白酶酶解時間和淀粉復合酶添加量）和BD（蛋白酶酶解時間和淀粉復合酶酶解pH）交互作用極顯著（＜0.01），AB（蛋白酶添加量和蛋白酶酶解時間）和CD（淀粉復合酶添加量和淀粉復合酶酶解pH）交互作用顯著（＜0.05）且等高線均表現出橢圓形。

圖3 AB、AD、CD、AC、BC和BD交互作用的響應面圖Fig.3 The response surface diagrams of the interaction of AB, AD, CD, AC, BC and BD

2.5 提取工藝優化和可靠性驗證結果

為進一步確認對玉米皮膳食纖維含量影響較大的四個因素的最佳條件，利用Design-Expert軟件進行分析，通過分析結果可以得到最大膳食纖維含量的條件參數：蛋白酶添加量為0.742%、蛋白酶酶解4 h、淀粉復合酶添加量為0.727%、淀粉復合酶酶解pH為6.76，在此工藝參數下玉米皮膳食纖維含量理論值為86.80%。依據此工藝參數進行三次驗證試驗，得到實際玉米皮膳食纖維含量實際平均值為86.65%，與理論值相差不大，這表明該模型優化后的玉米皮膳食纖維提取工藝較為可靠。

2.6 玉米皮膳食纖維理化功能性質分析

如表5所示酶法制備的玉米皮膳食纖維中主要以不溶性膳食纖維為主，可溶性膳食纖維僅為1.98%，制備的膳食纖維具有良好的持水性（WHC）和吸水膨脹性（SWC），分別為 3.93±0.17 g/g、3.70±0.20 mL/g。有研究結果表明，WHC與膳食纖維的結構有一定的關系。當接觸面積和膳食纖維中親水性基團增加時，水可以保留在親水部分或網狀纖維的空間結構中，從而改善WHC。另外，玉米皮膳食纖維還具有良好的持油性（OHC）和膽固醇吸附性（見表5），對豬油（3.47±0.19 g/g）的吸附效果明顯優于玉米油（2.59±0.01 g/g）、菜籽油（2.53±0.06 g/g）和大豆油（1.80±0.04 g/g），且膽固醇吸附性在 pH=2（胃環境 0.63±0.03 mg/g）優于 pH=7（腸道環境 0.31±0.02 mg/g），可以預防和治療肥胖等疾病。

表5 玉米皮膳食纖維含量及理化性質Table 5 Corn bran dietary fiber content and physicochemical properties

玉米皮膳食纖維對不同濃度葡萄糖均具有良好的吸附性，葡萄糖吸附性隨葡萄糖濃度增大而增大，由0.63 mmol/g逐漸增長至6.55 mmol/g，如圖4（A）所示。通過測定不同時間下玉米皮膳食纖維對體外脂肪消化模型的影響發現，當乳化劑中不存在玉米皮膳食纖維時，120 min后乳化劑被完全消化。然而，在玉米皮食纖維存在的情況下脂質消化的速率和程度明顯降低，120 min后FFAs釋放量為70.04%，如圖4（B）所示。葡萄糖吸附性是膳食纖維重要功能指標之一，膳食纖維的葡萄糖吸附性（GAC）與葡萄糖代謝功能有關，膳食纖維能夠在體內發酵產生短鏈脂肪酸，可以預防糖尿病。

圖4 玉米皮膳食纖維功能性質Fig.4 Functional properties of corn bran dietary fiber

3 結論

本研究對玉米皮膳食纖維的酶法制備工藝進行了響應面優化和功能性質研究。最佳酶解工藝為：堿性蛋白酶添加量0.742%、pH為10、溫度54 ℃、酶解 4 h；淀粉復合酶（淀粉酶:糖化酶=1:1（m/m））添加量 0.727%、pH為 6.76、溫度 65 ℃、酶解 2 h所得玉米皮膳食纖維含量為86.65%±0.72%；玉米皮膳食纖維中以不溶性膳食纖維為主，其持水性為3.93±0.17 g/g，膨脹性為 3.70±0.20 mL/g，對大豆油、玉米油、菜籽油和豬油的持油性分別為1.80±0.04、2.59±0.01、2.53±0.06、3.47±0.19 g/g，膽固醇吸附性在胃環境下為0.63±0.03 mg/g、腸道環境為0.31±0.02 mg/g。玉米皮膳食纖維對不同濃度的葡萄糖溶液具有良好的吸附性，且具有較強的體外抑制脂肪消化能力，可能與其含有較高的不溶性膳食纖維含量有關。本研究對提高玉米皮綜合利用，實現糧食加工副產物的提質增效具有重要的意義。