超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水果中9種真菌毒素

倪 楊，楊軍軍，石 磊，張瑩瑩，熊 融,

（1.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093；2.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093；3.農業農村部果品及苗木質量監督檢驗測試中心（北京），北京 100093）

水果是我國居民餐桌上的重要組成部分，其在整個生長周期以及采后加工、貯運銷售過程中，尤其在反季節銷售模式下的貯藏期間，易受真菌侵染而產生并積累具有毒性的次級代謝產物。目前，主要污染水果的真菌毒素有鏈格孢菌毒素（toxins，Ts）、展青霉素（Patuline，PAT）、赭曲霉毒素 A（Ochratoxine A，OTA）、橘青霉素（Citrinine，CIT）等，大多具有細胞毒性、胚胎毒性、致畸性、致癌性等多種毒性，可在人體內富集，給人類健康造成極大危害。此外，一直以來，人們在鮮食果品中存在一定的誤區，認為去除水果腐爛變質部位即可保證食用的安全性，但研究證明，周圍看似健康的部位同樣會受真菌侵染并產生毒素，如鏈格孢菌可使水果內部變質而外觀無明顯變化，且不能通過沖洗等方式去除毒素；OTA化學結構穩定，即使在高溫高壓條件下也難以完全分解；PAT是青霉屬、曲霉屬等60余種真菌的次級代謝產物，這些真菌廣泛污染果蔬、糧油及發酵食品，且在冷藏條件下、加工過程中穩定存在，致使毒素污染的范圍難以控制，危害難以防控。

鑒于真菌毒素的危害，很多國家和機構都制定了相應的限量標準和分析檢測方法，我國在GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中明確規定，PAT在以蘋果、山楂為原料的制品和飲料類食品中限量值為50 μg/kg。GB 5009.185-2016《食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定》分別以液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測蘋果、山楂及其制品中的PAT含量，使用LC-MS/MS法，不同試樣采用不同前處理方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分別為 1.5～6 μg/kg、5～20 μg/kg；使用 HPLC法液體試樣的 LOD為 6 μg/kg、LOQ為 20 μg/kg，固體、半流體試樣的 LOD 為 12 μg/kg、LOQ 為 40 μg/kg。此外，SN/T 4259-2015《出口水果蔬菜中鏈格孢菌毒素的測定》使用LC-MS/MS同時檢測4種Ts，適用于蘋果、梨、葡萄、獼猴桃、柑桔等樣品，方法的測定低限均為10 μg/kg。

在對真菌毒素檢測技術的探索中，基于抗體的免疫化學方法已發展得較為完善，準確的快速定性檢測體系已基本建成。而在精準定量檢測方面，超高效液相色譜法（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）、HPLC等作為主流色譜技術的代表，尤其與質譜聯用，憑借強大的分離能力和較好的靈敏度、準確性，已經發展成為真菌毒素檢測領域最為可靠的定性定量分析方法。然而，上述方法前處理操作繁瑣，難以滿足大批量樣品的快速檢測，QuECh-ERS作為一項新興的高效提取凈化方法，因其操作簡單、適用性廣、提取凈化效率高等優點，近年來也應用于水果中真菌毒素的檢測。曾有研究使用QuEChERS方法結合UPLC-MS/MS或HPLC-MS/MS 分別對紅棗、蘋果、葡萄、柑橘、芒果中的Ts進行檢測，其中，蘋果中5種Ts的LOQs為0.02～1.0 μg/kg，其余水果中多種Ts的LODs為0.11～12.4 μg/kg。張曉男等對QuEChERS進行改進，采用新型除水劑4A型分子篩，建立了UPLC-MS/MS同時檢測蘋果及其制品中Ts、PAT、OTA共7種毒素的定量分析方法，各毒素LODs和LOQs分別為 0.02～1.80 μg/kg、1～5 μg/kg。

前期主要針對單一水果中多種Ts開展檢測方法的研究，由于水果在生長發育、采收加工、貯運銷售過程中，受多種毒素復合污染的潛在風險較大。因此，本研究綜合利用 QuEChERS方法和 UPLCMS/MS技術的優勢，對提取溶劑、凈化方式及色譜質譜條件進行優化，建立適用于多種水果中多種真菌毒素的檢測分析方法，快速富集和凈化水果中9種真菌毒素，在保證較高回收率的情況下，簡化前處理步驟，相比已有方法具有檢出限低、分析時間短、適用范圍廣等優勢，實現水果中多種真菌毒素的快速定性定量檢測，以期為監測、評估水果中多組分真菌毒素的污染風險和確證檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

9種真菌毒素標準溶液及其濃度見表1 北京曼哈格生物科技有限公司；甲酸、乙腈 色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；乙酸、檸檬酸、乙酸銨 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉 分析純，現代東方（北京）科技發展有限公司；超純水 電阻率大于18.2 MΩ·cm，Milli-Q超純水機制備；微孔過濾膜 尼龍13 mm×0.22 μm，迪馬科技有限公司；ACQUITY UPLC BEH C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美國Waters公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C，60 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（primary secondary amine，PSA，60 μm） 日本島津公司；桃、櫻桃、蘋果、梨、草莓、葡萄等樣品 北京市各大超市。

ACQUITY UPLC I-Class液相色譜儀、Xevo TQS質譜儀（配有電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源及Masslynx4.1數據處理系統） 美國Waters公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；FE20型實驗室pH計 瑞士Mettler Toledo公司；BSA224S-CW型電子天平 感量0.1 mg，德國Sartorius公司；PL2002型電子天平 感量0.01 g，瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；ZD-85型氣浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；QL-8BB型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；L18-Y915S型食品粉碎機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 混合標準溶液：分別移取一定體積的9種真菌毒素標準溶液于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇稀釋并定容至刻度線，得到混合標準工作溶液，其中PAT質量濃度為500 μg/L，其余8種真菌毒素質量濃度均為100 μg/L。

空白基質溶液：另取經檢測不含9種真菌毒素的樣品，按照1.2.2節進行樣品前處理，制備空白基質溶液待用。

基質混合標準溶液：分別移取一定體積的9種真菌毒素標準溶液于10 mL容量瓶中，加入適量空白基質溶液稀釋并定容至刻度線，配制不同質量濃度的系列基質混合標準工作溶液。其中，PAT的標準工作曲線濃度為 5、10、50、100、250、500 μg/L，其余8種真菌毒素的標準工作曲線濃度均為1、5、10、20、50、100 μg/L。

所有黏度測量的方法，都有一定的局限性和適用范圍[5-6]。而目前在合成樹脂行業，實驗室測量最多的是旋轉法，包括旋轉黏度計和旋轉流變儀。具體型號有布氏旋轉黏度計、NDJ79旋轉黏度計、錐板高溫黏度計等。用于聚合反應終點判斷、中間產品過程監測、最終成品質量檢驗。

10 mmol/L檸檬酸-乙腈溶液：稱取1.92 g（精確到0.1 mg）檸檬酸于1 L容量瓶，加入乙腈溶解并定容。

1.2.2 樣品前處理 參考文獻[4, 24]中的前處理條件進行優化，具體如下：稱取10 g（精確到0.01 g）勻漿試樣置于50 mL離心管中，加入15 mL 10 mmol/L檸檬酸-乙腈溶液置于氣浴恒溫振蕩器中振蕩10 min，再加入烘干后的3.0 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，5000 r/min離心5 min。吸取6 mL有機相置于內含300 mg無水硫酸鎂、200 mg C的10 mL離心管中，渦旋振蕩0.5 min，常溫靜置5 min后，過0.22 μm有機濾膜于樣品瓶中，待測分析。

加標陰性樣品前處理：選取經檢測不含9種真菌毒素的樣品，在50 mL離心管中稱取10 g（精確到0.01 g）勻漿試樣，分別加入低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液（具體添加量詳見表4），按照上述方法進行樣品前處理。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C柱（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流動相：A 為乙腈，B為0.05%甲酸-水溶液；梯度洗脫程序：0～0.5 min、90%B；0.5～1.0 min、90%～40% B；1.0～3.0 min、40%～10% B；3.0～4.0 min、10% B；4.0～8.0 min、90% B。

1.2.4 質譜條件 離子源：ESI；掃描方式：正、負離子同時掃描；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔電壓：30 V；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；碰撞氣：高純氬氣；檢測模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）。

1.2.5 定性定量方法 結合質譜掃描所得質量數，采用兩個碎片子離子進行定性和定量，以響應較強、穩定較好的子離子的質荷比（m/z）作為定量離子，響應次強、干擾少的子離子作為定性離子。

1.3 數據處理

通過Waters Masslynx儀器配置工作站系統進行數據采集及定性、定量分析，利用Excel軟件進行數據分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

混合標準溶液直接進樣，根據化合物的性質，先對9種目標物進行Q1 MS Scan母離子全掃，確定一級質譜碎片離子母離子質荷比（m/z）并優化錐孔電壓，得到目標物的母離子和質譜參數。發現PAT在負離子模式下響應值高，分子離子峰為[M-H]；而其它8種化合物在正離子模式下響應值高，其中BEA分子離子峰為 [M+NH]，ALT、TeA、AOH、AME、TEN、OTA和CIT均為[M+H]。其次在Q2 MS/MS daughter Scan子離子掃描模式下進行二級質譜掃描，每個化合物選擇兩對特征離子對，以響應較強、穩定較好的碎片離子的質荷比作為定量離子，響應次強、干擾少的子離子作為定性離子，優化碰撞能量，確定質譜參數，9種真菌毒素MRM質譜參數見表1。

表1 9種真菌毒素檢測質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for 9 mycotoxins

2.2 色譜條件的優化

本研究比較了 CQUITY UPLC BEH C柱、ACQUITY UPLC HSS T3柱和 ACQUITY UPLC BEH HILIC柱對目標物的分離效果。結果發現，使用HSS T3柱時，ALT和TeA峰形較差，響應值較低；使用BEH HILIC柱時，ALT、PAT、TeA三種化合物均不出峰；而BEH C柱能夠在5 min內較好地分離9種化合物，且峰型更加對稱，故選定BEH C柱作為分析色譜柱。

圖1 9種真菌毒素的MRM色譜圖Fig.1 The MRM chromatograms of 9 mycotoxions

2.3 提取劑的選擇

大多數真菌毒素易溶于有機溶劑，乙腈和甲醇是目前最常用的兩種提取溶劑，甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易將樣品中的酸、酚、脂肪、色素等物質提取出來，致使提取液中雜質較多，不利于后續的鹽析和凈化。由于降低提取溶劑pH能提高部分毒素的穩定性和回收率，因此本實驗比較了乙腈、10 mmol/L 檸檬酸-乙腈、10% 甲酸-乙腈和0.1%乙酸-乙腈4種提取溶劑對9種真菌毒素提取效果的影響。

結果如圖2所示，采用純乙腈提取時，BEA回收率為136.7%，TeA回收率為76.4%，其余7種真菌毒素回收率為81.6%～104.1%。對乙腈進行3種不同程度的酸化后，BEA回收率分別降低為90.6%、85.8%、86.8%，TeA回收率分別提高為 90.7%、78.7%、86.5%。以10%甲酸-乙腈為提取溶劑時，PAT回收率最低，為74.2%。采用10 mmol/L檸檬酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈提取時，9種真菌毒素的回收率分別為86.0%～97.9%、81.5%～92.5%，考慮到檸檬酸更為經濟環保，因此選用10 mmol/L檸檬酸-乙腈溶液作為提取溶劑。

圖2 不同提取劑對9種真菌毒素回收率的影響Fig.2 Effects of different extractants on the recovery of 9 mycotoxins

2.4 凈化劑的選擇

在毒素提取的過程中，水果樣品中的色素、有機酸、糖類物質、酚類物質等組分也被部分提取，這不僅會影響痕量目標物的檢測，也會對色譜、質譜系統造成污染，為降低基質效應，需要對提取液進行凈化。參考QuEChERS技術中的凈化方法，選擇常用的PSA和C吸附劑，C作為非極性吸附劑能夠吸附基質中的非極性物質，有效去除樣品中的脂質、糖類等有機化合物；PSA是一種堿性吸附劑，在結構上有兩個氨基，可以通過氫鍵結合去除基質中的碳水化合物、有機酸、色素等。本研究比較了不同用量的PSA和C凈化對毒素回收率的影響。

結果如圖3所示，在100～400 mg用量下的PSA對AOH、TeA、OTA和CIT均有不同程度的吸附，其回收率為22.8%～68.4%；而C的凈化效果較好，當用量為200 mg時，9種真菌毒素的回收率最佳，為88.5%～108.9%。張曉男等、王玉嬌等在研究干/鮮果品中多種真菌毒素的提取方法時，也發現經C吸附劑凈化后，多種真菌毒素的回收率分別在75.6%～111.8%和77.5%～103.7%之間，結果較為滿意。因此，本實驗選用200 mg C進行凈化處理。

圖3 凈化劑對9種真菌毒素回收率的影響Fig.3 Effects of different purification reagents on the recovery for 9 mycotoxins

2.5 基質效應

為評價基質效應，采用基質標與溶劑標曲線斜率的比值考察了9種目標毒素在5種水果中的信號增強/抑制程度（signal suppression/enhancement, SSE），SSE值大于1.2表示存在基質增強效應，小于0.8表示存在基質抑制效應，在0.8～1.2之間則視為基質效應影響不大。測定結果如表2所示，在5種水果樣品中，PAT、ALT、AME和AOH基質抑制效應明顯（＜0.8），TEN、TeA基質增強效應明顯（＞1.2）；CIT僅在櫻桃樣品中基質抑制效應明顯；而BEA和OTA，在5種水果樣品中的基質效應尚在可接受范圍內（0.8～1.2）。因此本實驗采用空白基質外標曲線法進行定量，以補償基質效應。

表2 9種真菌毒素的基質效應Table 2 Matrix effects of 9 mycotoxins

2.6 方法學驗證

2.6.1 方法的線性關系、LODs和LOQs 取空白桃樣品，按照1.2.2進行樣品前處理，配制一系列濃度的基質混合標準工作液，上機測定后，分別以9種真菌毒素的色譜峰面積為縱坐標（Y），對應的質量濃度為橫坐標（X），進行線性回歸分析，計算回歸方程和相關系數，并根據信噪比（S/N）確定LOD（S/N=3）和LOQ（S/N=10），結果見表3。PAT的曲線濃度范圍與其它毒素不同，主要考慮了PAT的限量水平、儀器響應值等因素。各目標物在各自質量濃度范圍內，峰面積與質量濃度呈現良好的線性關系，在0.9991～0.9999之間。PAT的LOD和LOQ分別為 1.676、5.587 μg/kg，滿足 GB 2761-2017和 GB 5009.185-2016規定的測定要求。其它8種真菌毒素的LODs為 0.004～0.122 μg/kg，LOQs為 0.014～0.406 μg/kg，相關毒素均低于SN/T 4259-2015中制定的LODs，表明本方法具有較好的靈敏度和良好的定性定量分析能力。

表3 9種真菌毒素的線性范圍、LODs和LOQs（n=6）Table 3 Linear range, LODs and LOQs of 9 mycotoxins (n=6)

2.6.2 回收率與精密度 選取空白桃和櫻桃樣品為本底，對9種真菌毒素進行低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗，在優化的實驗條件下，每個加標水平重復測定6次，分別計算加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表4。在2種水果基質中，各毒素在低水平添加量下的平均回收率為84.5%～106.5%，RSDs為0.8%～4.0%；在中水平添加量下的平均回收率為85.9%～113.2%，RSDs為1.1%～2.9%；在高水平添加量下的平均回收率為86.1%～111.3%，RSDs為0.7%～3.3%，符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》的技術要求，表明本方法具有良好的準確度和精密度。

表4 9種真菌毒素的加標回收率和RSDs （n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of 9 mycotoxins (n=6)

2.7 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對從超市購買的草莓（10份）、櫻桃（5份）、葡萄（10份）、蘋果（10份）、梨（10份）共計45份樣品進行檢測，結果發現3份樣品中檢出真菌毒素，分別為櫻桃樣品2份、葡萄樣品1份，陽性率為 6.67%，所檢測到的真菌毒素有PAT（檢出率 6.67%）、ALT（檢出率 6.67%）、TeA（檢出率 4.44%）、AOH（檢出率 2.22%）、AME（檢出率2.22%）、TEN（檢出率 2.22%）和 BEA（檢出率2.22%）。如表5所示，有 2份櫻桃樣品共檢出PAT、ALT、TeA和BEA 4種真菌毒素，1份葡萄樣品中檢出 PAT、ALT、TeA、AOH、AME和 TEN 6種真菌毒素。

表5 市售水果中真菌毒素的檢測結果Table 5 Detection results of mycotoxins in commercial fruits

PAT和Ts是水果中污染最為廣泛、危害最大的重點毒素，其產毒真菌是櫻桃和葡萄采后貯藏過程中的主要病原菌，同樣廣泛污染蔬菜、糧食、油料等作物，在草莓、櫻桃、葡萄、蘋果、梨、桃等果品中均有檢出。據報道，新鮮水果中很少有PAT產生，由青霉、曲霉等引起的腐爛水果樣品中，PAT陽性率和檢出濃度較高。鏈格孢菌可在水果貯運過程中的低溫潮濕環境下生長，易于含水量和水分活度高的水果中增殖，漿果類水果的毒素檢出率較高。本次超市抽檢的小粒、易腐的櫻桃和葡萄中，部分樣品均含有PAT和ALT，而9種真菌毒素在草莓、蘋果、梨樣品中均未檢出，可能與水果的新鮮程度、包裝形式及貯藏條件等因素有關。

3 結論

本研究建立了QuEChERS前處理方法結合UPLC-MS/MS技術同時測定水果中9種真菌毒素的分析方法。實驗優化了色譜質譜條件，使9種毒素擁有較合適的出峰時間、較好的峰形和較高的響應值，并通過優化提取溶劑、凈化方法等前處理條件有效減少樣品的基質干擾。建立的檢測方法中，9種真菌毒素在5 min內完成色譜分離分析，在各自質量濃度范圍內線性關系良好（＞0.999），檢出限低，靈敏度高。桃和櫻桃樣品中低、中、高3個添加濃度水平的加標回收率在84.5%～113.2%之間，RSDs為0.7%～4.0%（n=6），結果較為滿意。與以往單一水果種類中以Ts為主的檢測方法相比，本方法操作簡單、快速、毒素種類多、適用范圍廣，方法學驗證及實際樣品檢測結果表明其靈敏度高、精密度好、實用性強，可以實現9種真菌毒素的有效分離和準確定量測定，滿足水果中痕量毒素定量分析的要求，對監測、評估水果中多組分真菌毒素的污染風險評估和確證檢測具有參考意義。

實際樣品測定結果顯示，有2份櫻桃樣品共檢出PAT、ALT、TeA和BEA 4種毒素，1份葡萄樣品檢出 PAT、ALT、TeA、AOH、AME和 TEN 6種毒素，其余樣品中均無毒素檢出。實驗結果表明售價較高、貨架期較短的小粒、易腐類水果，在貯藏、銷售過程中，存在真菌毒素混合污染的安全隱患，應給予持續關注。目前針對水果中的真菌毒素限值標準相關甚少，我國僅對蘋果、山楂及其制品中的PAT規定了限值和測定方法，有必要健全水果中的真菌毒素限量標準及檢測標準。