人參-丁香醇提物抑制高山被孢霉脂質合成的活性評價

倪偉鋒，趙大慶，倪以宇，白竹林，王思明

（長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春 130000）

肥胖是目前全球最主要的公共健康問題之一，主要是機體長期能量攝入超過能量消耗，使能量經各種脂肪酸合成相關酶的作用合成脂肪酸，并最終以甘油三酯的形式在白色脂肪或其他器官中過度堆積。臨床上很多疾病都是因長期肥胖而衍生來的，由肥胖所引起的疾病可謂遍及全身各個系統，尤以糖尿病、高血壓、高尿酸血癥等疾病與肥胖關系更為密切，對人類健康構成巨大威脅。

人參，五加科植物人參C.A.Meyer的干燥根和根莖，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺之功，用于體虛欲脫、脾虛食少、久病虛贏之證，于2012年被批準為新資源食品。丁香，桃金娘科植物丁香Thunb.的干燥花蕾，具有溫中降逆、補腎助陽之效，用于脾胃虛寒、呃逆止嘔、食少吐泄之證，是2002年被批準的首批藥食同源的中藥材。中醫學認為，肥胖之人往往脾腎陽虛、嗜食肥甘、喜靜少動，主要病機為脾氣兩虛，在古代經方中就有許多人參丁香互相配伍用于補氣健脾的記載，比例常為1:1、1:2和2:1，且常用方法為水煎煮和酒浸泡。研究發現人參、丁香單味用藥在抗氧化、抗腫瘤、抗炎、以及治療肥胖有較好的成效，而其配伍共同作用于治療肥胖的研究鮮有報導。

高山被孢霉（，MA）是白色絲狀真菌，一種重要的產油微生物，其油脂含量是其干重的50%以上，高山被孢霉的脂肪酸合成酶（FASN）由乙酰基轉移酶、丙二酸單酰基轉移酶、-烯脂酰還原酶、-羥脂酰脫水酶、-酮脂酰還原酶、-酮脂酰合酶和1個酰基載體蛋白組成，在相關酶和載體蛋白的作用下使得脂肪酸合成，這與哺乳動物類似，哺乳動物的FASN是一類多功能酶，是機體內脂質合成過程中的一個關鍵酶，能夠催化細胞中長鏈脂肪酸的從頭合成，通過抑制FASN活性抑制脂質從頭合成，一定程度上維持機體能量的平衡，也因其所含FASN與哺乳動物具有的相似性而被評為一種脂質合成抑制劑篩選的平臺；而奧利司他（Olistat），能夠與FASN相關酶結合，阻止FASN催化的最后一步棕櫚酸的釋放，被美國食品和藥物管理局（FDA）認證為減肥藥物。

本文借助高山被孢霉和3T3-L1脂肪細胞研究人參-丁香抑制脂質合成作用，并對其機制進行初步探索，為從藥食同源食品中尋找以膳食補充劑達到食療緩解肥胖提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高山被孢霉（ATCC32222） 購于中國微生物菌種保藏管理中心；3T3-L1前脂肪細胞（Procell CL-0006）、3T3-L1專用培養基、DMEM/F12培養基購于武漢普諾賽生命科技有限公司；TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）、MTT（四甲基偶氮唑藍）、麥芽汁瓊脂培養基 購于北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒 購于碧云天生物技術公司；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）、胰酶（0.25% 胰酶-EDTA（600 U/mL））、胎牛血清 購于美國Hyclone公司；引物 由吉林省庫美生物科技有限公司合成；逆轉錄試劑盒 購于Takara。

Infinite M200 PR0全自動酶標儀 瑞士Tecan公司；CFX Connect PCR儀 美國 Bio-rad公司；6700F型掃描電鏡 日本電子；GCMS-TQ8040NX氣相色譜-質譜聯用儀、UV-2550型紫外可見光度計日本島津公司；Innova 40搖床 德國Eppendorf公司；SX-700蒸汽滅菌器 日本Tomy Digital Biology公司；T10 bcsic型分散器 德國IKA公司；Kendro CO細胞培養箱 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理

1.2.1.1 不同藥材比例 將人參、丁香分別粉碎后按不同比例1:1、1:2、2:1混勻，每種比例4份，共12份待用。

1.2.1.2 不同提取溶劑 將上述混勻藥材分別以1:10料液比進行水煎煮，并用100%乙醇、70%乙醇和50%乙醇分別進行回流提取，保持沸騰狀態提取1.5 h后過濾，重復兩次，合并兩次濾液旋轉蒸發至溶劑去除，得到12種固體提取物。

1.2.2 人參丁香提取物對高山被孢霉脂肪合成的抑制作用研究

1.2.2.1 菌株的培養及提取物的篩選 將高山被孢霉在麥芽汁瓊脂固體培養基中培養后，取之于肯德里克肉湯（Kendrick Broth）培養液（20 g/L葡萄糖，5 g/L 酵母提取物，1 g/L KHPO，0.25 g/L MgSO·7HO，10 g/L KNO）中活化三代，將活化的MA按1%接種量轉接至100 mL Broth培養液，28 ℃培養72 h，分散器打散，稀釋至0.5光密度（OD）值后接種于96孔板中。每孔加入0.1% TTC和5 μg/mL上述不同提取物，并設置溶劑陰性的空白對照組與5 μg/mL奧利司他陽性對照組，將96孔板放置于28 ℃培養箱中，暗處培養72 h后于酶標儀在485 nm處測OD值。

1.2.2.2 給藥擴大培養及保存 將1.2.2.1中菌液以1%的接種量轉接于新的Broth液體培養基用于擴大培養。實驗組加入1.2.2.1篩選出的人參丁香比為1:2的100%乙醇提取物（alcohol extract of genseng and clove，AEGC），設置給藥量為 5 mg/L AEGC 的給藥組，空白對照組加入相同體積的DMSO溶劑和5 mg/L奧利司他陽性對照組，在28 ℃、200 r/min的搖床中培養5 d。用分散機打散菌體，吸取5 mL混勻的菌液過濾，洗滌3遍，收集菌體于離心管中，冷凍干燥后獲得干重。過濾出剩余菌體，洗滌3遍，取約1/3菌體-80 ℃保存，用于酶活分析，剩余約2/3菌體經冷凍干燥得到干菌-80 ℃保存，用于單試劑GPOPAP法測定甘油三酯含量、BCA法測定蛋白含量，以及總脂肪酸含量測定、脂肪酸組分分析和RNA提取、反轉錄及RT-qPCR。

1.2.2.3 電鏡觀察 取上述1.2.2.2中擴大培養的高山被孢霉挑取少量菌絲轉接至L-多聚賴氨酸包被細胞爬片，并用戊二醛固定吹干后做為掃描電鏡的樣品，離子濺射儀噴金制片，在掃描電鏡下以3000 V電壓、7.6～7.7 mm工作距離下，使用500～2000倍放大倍數觀察拍照。

1.2.2.4 酶活分析 取1.2.2.2中適量菌體于研缽，倒入液氮研磨并不斷添加液氮研磨，重復多次，加入適量含有20%甘油的酶提取緩沖液（100 mmol/L KHPO/KOH，pH7.5，1 mmol/L苯 甲 脒 鹽 酸 ，1 mmol/L DTT），5 min，10000 r/min，4 ℃ 離心兩次，取上清液即得到酶提取液，用BCA法測定破碎上清液中的蛋白濃度，并測定蘋果酸酶（Malic enzyme，ME）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-P）和 ATP 檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）活力，嚴格按照 ELISA 試劑盒測定脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，FAS）活力。

1.2.2.5 脂肪酸分析 將1.2.2.2中凍干后的菌體置于研缽中進行研磨粉碎，稱取50 mg菌粉置于已加入2 mL 4 mol/L鹽酸的凍存管中，對菌體進行破壁處理，隨后置于80 ℃水浴1 h后迅速轉至-80 ℃中冷凍15 min，如此重復三次后，萃取得無色液體至氮氣吹干得粗脂，再經鹽酸-甲醇甲酯化后萃取得到得脂肪酸甲酯經GC-MS檢測，與37種混合脂肪酸標品比較進行分析。

1.2.2.6 RT-qPCR 用Trizol從上述1.2.2.2的MA中分離出總RNA，利用逆轉錄試劑盒將RNA反向轉錄到cDNA。引物序列見表1。采用CFX連接實時系統（Bio-Rad，美國）進行RT-qPCR，采用以下實驗條件：階段 1（1 次循環）95 ℃ 30 s，階段 2（40 次循環）95 ℃ 5 s；54 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s；擴增完畢后，以18sRNA為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的CT值，采用2法進行相對基因表達量分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 人參丁香提取物對3T3-L1前脂肪細胞作用研究1.2.3.1 增殖抑制作用測定 采用MTT法來測定AEGC對細胞的毒性作用，將胰酶消化培養液重懸的3T3-L1前脂肪細胞以 5×10個/孔接種于96孔板，100 μL專用培養基每孔，平行6個孔，于37 ℃、5% CO培養箱中靜置培養24 h，倒掉培養液，更換為100 μL加有不同濃度AEGC和奧利司他陽性對照的專用培養基繼續培養48 h后，參照細胞存活率（%）=[（實驗組OD-不含細胞的等量培養基OD）/（空白組OD-不含細胞的等量培養基OD）]×100常規方法，于每孔中加 MTT溶液 20 μL，孵育 4 h后，吸去培養液和MTT，加入DMSO后，于490 nm處測吸光密度（OD）值。

1.2.3.2 給藥干預誘導分化 將脂肪細胞以5×10個/孔接種于96孔板，專用培養基培養待細胞接觸抑制，將其放置在含10% FBS的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培養基中培養2 d，換于含10% FBS、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰島素的DMED高糖培養基中培養2 d，換于含10%胎牛血清和10 μg/mL胰島素的DMEM培養2 d，隨后以10% FBS培養基中繼續培養，每2 d更換一次培養液。將加入地塞米松等誘導劑算作分化第1 d，從第1 d起，實驗組分別給予含不同濃度的AEGC和奧利司他，全程干預細胞分化過程，之后對其抑制作用進行測定。

1.2.3.3 細胞分化抑制作用測定 取上述1.2.3.2中第8 d分化的細胞每孔加MTT溶液20 μL，孵育4 h后，吸去培養液和MTT，加入DMSO于酶標儀在490 nm處測吸光密度（OD）值，檢測AEGC對細胞分化過程中細胞的毒性。細胞分化的第8 d嚴格按照試劑盒方法每孔加入油紅，進行油紅O染色拍照和異丙醇洗脫油紅半定量檢測脂質生成率（%）=[（實驗組 OD-空白組 OD）/（對照組 OD-空白組 OD）]×100。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 人參丁香提取物對高山被孢霉脂肪合成的抑制作用

使用脂溶性光敏感復合物TTC試劑篩選抑制高山被孢霉脂肪合成的結果如圖1所示，人參-丁香比為1:1、1:2、2:1的100%乙醇提取物在72 h干預后的OD值和空白組有顯著差異（＜0.05），其中，1:2的人參丁香100%乙醇提取物（AEGC）差異最大（＜0.01）顯著優于陽性結果（＜0.05），說明此提取物在所有提取物中最大的抑制了MA的脂質合成，結合表2所示的提取率，1:2人參丁香的100%乙醇提取物提取率在同層次中最高，且抑制脂質合成能力最強，故使用AEGC進行后續實驗探索抑制脂質合成機制。

圖1 TTC篩選MA脂質合成抑制初步結果Fig.1 Preliminary results of TTC screening for MA lipid synthesis inhibition

表2 人參丁香不同比例和不同溶媒的提取率Table 2 Extraction rate of different proportions of ginseng cloves and different solvents

2.2 AEGC作用高山被孢霉后電鏡下形態變化

高山被孢霉形態如圖2所示，在放大500倍鏡下總體形態無明顯差異，而在放大2000倍鏡下，陽性組和給藥組菌絲的粗細度更均勻，內含油脂的藕節狀菌絲較空白組幾乎不可見。通過對高山被孢霉的給藥擴大培養，提取物AEGC可能會減少MA的脂質積累。

圖2 高山被孢霉電鏡形態Fig.2 Mortierella alpina electron microscope morphology

2.3 AEGC作用高山被孢霉后甘油三酯和蛋白含量

MA中所含的甘油三酯含量和蛋白含量如圖3所示，給藥組和陽性組的甘油三酯含量極顯著小于空白組甘油三酯含量（＜0.01），而MA所含的蛋白質含量無顯著差異（＞0.05），由此推測，提取物AEGC能不減少蛋白含量而抑制甘油三酯的積累以免對高山被孢霉產生損傷。

圖3 高山被孢霉蛋白含量和甘油三酯含量Fig.3 Mortierella alpina protein content and triglyceride content

2.4 AEGC作用高山被孢霉后酶活分析

高山被孢霉中蘋果酸酶（ME）、ATP-檸檬酸裂解酶（ACLY）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-P）和脂肪酸合酶（FAS）酶活力如圖4所示，給藥組和陽性組的酶活力較空白組顯著降低（＜0.05），因丙二酸單酰輔酶A與乙酰輔酶A在FAS的催化下合成脂肪酸；ACLY在丙酮酸進入線粒體合成檸檬酸再進入細胞質產生乙酰CoA過程中發揮著十分重要的作用；G-6-P和ME共同提供脂肪酸合成所需的NADPH，ME產生的NADPH很多將用于脂肪酸的合成，故推測AEGC能通過抑制ME、ACLY、G-6-P和FAS的酶活力，從而抑制高山被孢霉脂質的合成與積累。

圖4 AEGC作用后高山被孢霉酶活力Fig.4 Enzyme activity of Mortierella alpina after AEGC

2.5 AEGC干預擴大培養高山被孢霉脂肪酸含量分析

擴大培養高山被孢霉的脂肪酸含量氣質分析如表3所示，共檢出25種不同的脂肪酸，發現實驗組中高山被孢霉C14:0、C16:0、C18:0和C20:0脂肪酸以及多種脂肪酸含量顯著減少（＜0.05），同時總脂肪酸的含量也明顯減少，與奧利司他陽性結果趨勢一致，以此推測AEGC可能是潛在的脂質合成抑制劑。

表3 高山被孢霉脂肪酸含量GC-MS分析（mg/g）Table 3 GC-MS analysis of fatty acid content of Mortierella alpina (mg/g)

2.6 AEGC作用高山被孢霉后相關基因PCR分析

為了進一步研究AEGC對脂質合成的機制，選擇了、、和作用于脂質合成機制中重要的因子，結果如圖5所示，給藥組和陽性藥組的這些基因表達量均顯著減少（＜0.05），因ACC和FAS是脂質生成的必需和限速底物，ACLY亦是脂質合成重要酶之一，且ME為脂肪酸的合成提供了NADPH，故推測AEGC對高山被孢霉脂質合成的抑制作用可能是通過下調相關mRNA的表達以影響高山被孢霉從頭合成脂肪生成。

圖5 高山被孢霉脂質合成相關酶表達Fig.5 Lipid synthesis-related enzyme expression of Mortierella alpina

2.7 細胞增殖

MTT法檢測AEGC對3T3-L1脂肪細胞增殖抑制作用結果如圖6所示，在加入不同濃度（10、20、30、40和 50 μg/mL）的 AEGC 培養 48 h后，和空白對照組相比，AEGC給藥組以及濃度為 20、30 μg/mL的陽性組脂肪細胞活力顯著下降（＜0.05），均表現出對脂肪細胞增殖有較強的抑制作用，并且隨著藥物濃度的升高對細胞增殖的抑制作用越強。

圖6 AEGC對3T3-L1前脂肪細胞增殖抑制作用Fig.6 The inhibitory effect of AEGC on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

2.8 細胞分化

MTT法檢測3T3-L1脂肪細胞分化后細胞的活力結果如圖7所示，在給藥干預誘導后，和空白對照組相比較，給藥干預脂肪細胞的分化并不會對脂肪細胞產生明顯的細胞毒性。

圖7 給藥誘導后細胞活力Fig.7 Cell viability after induction of administration

2.9 3T3-L1脂肪細胞油紅染色及半定量分析

油紅O染色法半定量分析誘導后3T3-L1脂肪細胞胞內的脂質含量，結果如圖8所示，較空白對照組，給藥組（20、30 μg/mL）和陽性藥組被油紅染色的紅色戒環明顯減少，通過異丙醇洗脫，給藥組和陽性藥組脂肪細胞的脂質含量顯著減少（＜0.05），表明AEGC能抑制3T3-L1分化為脂肪細胞的脂質合成和積累。

圖8 油紅染色洗脫和拍照結果Fig.8 Oil red staining elution and photographing results

3 結論

本次研究在微生物方面，利用TTC初步篩選出用于抑制脂質合成的人參丁香比為1:2的100%乙醇提取物，在給藥干預后通過掃面電鏡觀察和脂肪酸氣質分析，發現霉內脂質減少，也發現脂質合成途徑中ACC、FAS、ME等重要因子其酶活被抑制及其mRNA表達量減少，AEGC表現出較好的抑制高山被孢霉脂質合成能力；在細胞水平，通過經典雞尾酒誘導方式，在AEGC干預誘導3T3-L1前脂肪細胞分化的脂肪細胞在經油紅O染色半定量分析，發現其對3T3-L1前脂肪細胞分化過程中脂質的積累起到了一定程度的抑制作用。綜上AEGC能夠抑制高山被孢霉的脂質合成和3T3-L1細胞分化的成脂積累，本結果評估了AEGC對高山被孢霉脂質代謝的影響和細胞層面的初步探究，對治療肥胖癥提供了一個新的可選方案。