菜心小孢子培養(yǎng)技術的研究進展

任海龍，周賢玉，孫藝嘉，李光光，江定，張華，戴修純，張晶，鄭巖松

（廣州市農業(yè)科學研究院， 510308）

菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee）又名菜薹，是嶺南地區(qū)栽培規(guī)模最大的特產蔬菜之一，僅廣東省每年的栽培面積就在300萬畝（20萬hm2）次以上。近年來，以寧夏為代表的菜心產業(yè)化布局快速發(fā)展，使之成為一種全國性的大宗蔬菜，在我國蔬菜生產中的地位越來越重要[1]。菜心主要通過雜交選育的方式獲得新品種，選育過程一般需6～8代，相當費工費時，且長期自交還會出現(xiàn)種性衰退現(xiàn)象[2]。整齊一致且生產性能強的雜交菜心品種是當前育種追求的主要目標。應用游離小孢子培養(yǎng)技術獲得單倍體，進而加倍成后代完全純合的雙單倍體植株（DH植株），可在短時間內獲得純合、穩(wěn)定的育種材料，從而大幅度縮短育種年限，并且還能分離得到隱性性狀，在創(chuàng)制菜心優(yōu)良自交系和提高育種效率方面具有明顯優(yōu)勢，因而備受關注[3～10]。

1982年Robert[11]首次利用小孢子培養(yǎng)技術，成功獲得了甘藍型油菜的小孢子胚狀體及其再生植株。自此以后，游離小孢子培養(yǎng)技術進入了快速發(fā)展階段，國內外已先后將小孢子培養(yǎng)技術應用到油菜[12]、大白菜[13，14]和甘藍類蔬菜[15]的育種中。 我國在20世紀90年代中期才報道了菜心小孢子培養(yǎng)的研究[16]，相對于其他十字花科蔬菜，菜心小孢子培養(yǎng)的起步晚，難度大，還未有培育出品種的報道。

菜心繁種田

1 菜心小孢子培養(yǎng)的影響因素

1.1 基因型

基因型被認為是影響菜心游離小孢子成胚的首要因素。朱允華等[4]以特早50、青梗菜心和四九菜心（19）為供試材料，分析了影響菜心游離小孢子培養(yǎng)的因素，認為基因型對小孢子培養(yǎng)起著決定性的作用，不同材料間誘導頻率差異顯著；曾小玲等[5]以11個不同基因型的菜心栽培品種為試材，結果有7個基因型材料獲得小孢子胚，且不同基因型誘導形成胚的頻率存在顯著差異，同樣表明基因型是影響菜心小孢子胚發(fā)生的重要因素；Wong等[17]進一步研究發(fā)現(xiàn)，晚熟類型比早熟類型菜心小孢子的出胚率高。近年來，楊易等[8]和趙艷艷等[9]對不同基因型菜心進行了小孢子離體培養(yǎng)的胚胎誘導研究，結果均表明，基因型是決定菜心品種能否出胚的一個重要因素，不同基因型試材間小孢子胚誘導率具有明顯差異。

1.2 生理狀態(tài)

單核靠邊期被認為是小孢子成胚誘導的最佳時期，小孢子發(fā)育時期通常需要在顯微鏡下鏡檢確定。為了取樣方便，Wong等[17]提出花蕾在2.0～2.9 mm時的出胚率最佳；龐強強等[2]研究也發(fā)現(xiàn)菜心小孢子發(fā)育時期與花蕾和花藥外部形態(tài)特征密切相關，得出單核靠邊期的花蕾縱徑3.05～3.39 mm，花萼長3.25～3.46 mm，花瓣長2.10～2.33 mm，瓣萼比為0.63～0.71，花藥長2.57～2.89 mm、瓣藥比為0.77～0.85，可作為不同材料花蕾最佳取樣時期的鑒定指標，為菜心小孢子花蕾的選擇提供了依據。

另外，植株生長的環(huán)境條件也會影響小孢子胚或胚狀體的產量。曾小玲等[5]的試驗結果表明，當晝夜氣溫在12～24℃時菜心胚誘導率較高，夜溫低于10℃或日溫高于30℃時均不利于菜心游離小孢子的出胚，春季小孢子培養(yǎng)的脫分化能力比秋季高。

1.3 預處理

小孢子培養(yǎng)需要打破配子體原有的發(fā)育方向，溫度調節(jié)是主要手段。朱允華等[4]認為，4℃低溫預處理幼花穗可明顯提高小孢子胚狀體的誘導率；Cao等[16]研究認為，在小孢子培養(yǎng)體系中，將過濾后的菜心小孢子于33℃熱激處理1 d，對游離小孢子的膨大至關重要，不進行熱激處理或熱激處理3 d都會明顯抑制小孢子的成胚；Wong等[17]發(fā)現(xiàn)，32℃熱激處理48 h出胚效果更好。

1.4 培養(yǎng)基及其添加物

菜心小孢子培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基和NLN培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基用于沖洗液，NLN培養(yǎng)基用于胚狀體誘導。通常還會添加蔗糖、NAA、6-BA和活性炭等促進小孢子胚胎的發(fā)育。當前已發(fā)表的菜心小孢子培養(yǎng)基配方如表1。

表1 已發(fā)表的菜心小孢子培養(yǎng)基配方

蔗糖濃度為100～170 g/L的NLN培養(yǎng)基是進行菜心小孢子胚誘導的基礎培養(yǎng)基。楊易等[8]采用不同蔗糖濃度和激素配比的誘導培養(yǎng)基，對不同基因型菜心進行小孢子離體培養(yǎng)的胚胎誘導，認為不同蔗糖濃度的NLN誘導率差異顯著，NLN-10誘導效果最佳，出胚率最高，達30.46胚/皿，在NLN-10中分別添加0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，能顯著提高出胚率，是不加激素NLN-10處理出胚率的1.5倍，但該激素組合對難出胚的試驗材料無促進出胚作用，且當6-BA和NAA濃度均提高到0.2 mg/L時，胚胎生長發(fā)育受到抑制；趙艷艷等[9]以10個菜心品種為試材進行小孢子培養(yǎng)及體系優(yōu)化，結果表明，同一基因型在不同培養(yǎng)基成分誘導條件下，添加活性炭對小孢子胚狀體誘導率的影響較大，培養(yǎng)基中蔗糖質量濃度為130 g/L時胚誘導率最高，在培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以顯著提高菜心胚狀體誘導率；此外，朱允華等[4]也認為培養(yǎng)基中加入活性炭可改善胚的分化；與固定的蔗糖濃度NLN培養(yǎng)基不同，曾小玲等[5]提出熱激培養(yǎng)第1天用170 g/L高濃度蔗糖培養(yǎng)之后轉換成含130 g/L蔗糖培養(yǎng)基能顯著提高小孢子胚誘導率，同時添加0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA能促進菜心小孢子誘導成胚，添加0.4 mg/L GA3可顯著提高菜心小孢子胚芽誘導率和平均每胚出芽數(shù)；顧宏輝等[3]在前人研究的基礎上，以早熟菜心品種油青四九為供體材料，認為熱激誘導后更換培養(yǎng)液比不換培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)能明顯改善胚狀體質量，提高正常胚狀體比例；近年，牛劉靜等[6，7]在大白菜培養(yǎng)體系的基礎上建立了增城菜心和連州菜心的小孢子培養(yǎng)體系，并探討了細胞器抗氧化劑（VcNa）和植物生長調節(jié)劑（BR和TDZ）對小孢子胚胎發(fā)生及胚狀體再生成苗的影響，認為在NLN-13培養(yǎng)基中添加適宜濃度的BR或TDZ可顯著提高連州菜心小孢子胚胎發(fā)生率和直接成苗率，擴展了原有小孢子添加物的種類。

2 菜心染色體加倍與植株再生

染色體加倍是培育菜心雙單倍體植株的關鍵。顧宏輝等[3]的研究表明，游離小孢子培養(yǎng)的菜心具有較高比例的自發(fā)二倍體（70%）及四倍體（8%），較少的混倍體，這與甘藍型油菜再生植株的倍性分布相反，可以省去加倍等繁瑣步驟，能直接應用于育種研究中。龐強強等[10]對3份不同基因型的菜心研究發(fā)現(xiàn)，再生植株的二倍體自然加倍率在62.22%～71.11%，75 mg/L秋水仙素處理可以提高再生株系的二倍體率。

3 存在問題與發(fā)展方向

雖然菜心的小孢子培養(yǎng)已經取得了一定的進展，但是目前菜心尚未形成統(tǒng)一的小孢子培養(yǎng)體系，且出胚率和植株成苗率仍然不是很高，體系的重復性和穩(wěn)定性都不好，致使還未能在育種中應用。如新近發(fā)表的文章中，趙艷艷等[9]認為，130 g/L蔗糖濃度NLN（NLN-13）小孢子胚誘導率最高，在培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以顯著提高菜心胚狀體誘導率；而楊易等[8]則認為，100 g/L蔗糖濃度NLN（NLN-10）小孢子胚誘導率最高，130 g/L蔗糖濃度NLN（NLN-13）會明顯降低菜心的出胚率，分別添加0.1 mg/L 6-BA和NAA的出胚效果最佳。所報道的菜心小孢子培養(yǎng)體系大相徑庭，建議今后應從以下3個方面著手開展工作。

菜心小孢子胚狀體和幼苗

①對已報道的菜心小孢子體系進行優(yōu)化，找到一種適合各菜心基因型的普適型培養(yǎng)體系，使小孢子培養(yǎng)技術得到更廣泛的應用。

②在此基礎上，進一步簡化和完善菜心小孢子培養(yǎng)體系中預處理方式、培養(yǎng)基成分及外源添加物等方案，大幅提高小孢子的出胚率。

③開展菜心小孢子胚胎發(fā)育過程和發(fā)育途徑的基礎研究，為完善菜心單倍體育種技術提供理論基礎和依據。