紐甜液相色譜檢測方法優(yōu)化

董立君，賽麗諾，孟千軍，張貴秋，王珊珊，張曉曉

（1.濰坊市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東濰坊 261000；2.濰坊市檢驗(yàn)檢測中心，山東濰坊 261000）

紐甜是一種白色結(jié)晶粉末狀物質(zhì)，由美國孟山都公司和法國里昂大學(xué)聯(lián)合研制，1993年取得化合物專利，2013年9月專利到期，從而在全球得到廣泛應(yīng)用[1]。紐甜作為一種非營養(yǎng)類增甜劑，甜度為蔗糖的8 000～10 000倍，穩(wěn)定性較好，在450 ℃高溫焙烤后仍有85%存在[2]。此外，紐甜在血液中存留時(shí)間較短，能被人體代謝，同時(shí)代謝產(chǎn)物不會(huì)在體內(nèi)積累，是一種相對安全的人工合成甜味劑。

紐甜具有以下特征：①穩(wěn)定性好，不會(huì)對香味、色澤、透明性、黏性等穩(wěn)定性指標(biāo)產(chǎn)生影響；②甜味純凈，沒有苦、酸、金屬的異味；③在低濃度0.5 μg·mL-1時(shí)，也具有增強(qiáng)改善風(fēng)味的作用；④無論是在高于或者低于甜度閾值使用，均具有風(fēng)味休整和增強(qiáng)口味的特征。因?yàn)榧~甜作為人工合成甜味劑有穩(wěn)定性好、甜度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用在食品生產(chǎn)加工中。但由于技術(shù)壁壘可能存在一定的安全隱患，添加超量或違法添加等情況不利于人類的健康，對此食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2760—2014》中對其添加量有詳細(xì)規(guī)定。

在現(xiàn)行有效的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.247—2016[3]中，流動(dòng)相采用了離子對試劑緩沖液和梯度洗脫的方式，但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)此方法目標(biāo)物附近出現(xiàn)干擾峰。為有效解決此問題，特對方法進(jìn)行優(yōu)化。

樣品選擇蝦油蘿卜，其成分比較簡單，等度洗脫完全可以較好分離定量紐甜。紐甜在干燥的貯存條件下非常穩(wěn)定，但制成水溶液后其穩(wěn)定性會(huì)隨著pH和溫度的改變而顯著變化，文獻(xiàn)表明其在pH 3.0～5.5相對穩(wěn)定[4]，所以選擇1.5 g·L-1磷酸氫二銨溶液（用1 mol·L-1磷酸溶液調(diào)pH為3.0～3.5）和乙腈作為流動(dòng)相（使用時(shí)配制）。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

磷酸氫二銨：分析純、上海光復(fù)；三乙胺、甲酸：色譜純、科密歐；乙腈：色譜純、美國賽默飛世爾科技公司；紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：165450-17-9）：北京壇墨、純度99%；固相萃取柱：HLB SPE Cartridge 200 mg/6 mL（60 μm）；Vanquish Core 高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：納普C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：218 nm；流動(dòng)相：乙腈∶磷酸氫二銨溶液（0.02 mol·L-1）=30 ∶ 70；洗脫方式：等度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

取1 000 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液用混合提取液（吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1 000 mL，pH約為 4.5）配制成濃度分別為 0.2 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和 20.0 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

各準(zhǔn)確稱取10 g（精確到0.000 1 g）蝦油蘿卜將其勻漿置于3個(gè)50 mL具塞離心管中，依次加入100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液 20 μL（定量限）、100 μL（5 倍定量限）和 1 000 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液 100 μL（醬腌菜紐甜限量0.01 g·kg-1），然后各加入30 mL混合提取液，混勻超聲15 min，用混合提取液定容至刻度。分別離心取10 mL上清液，以1 mL·min-1的流速通過HLB固相萃取柱，棄去流出液，用5 mL甲醇以1 mL·min-1的流速洗脫，40 ℃水浴氮吹濃縮，混合提取液定容至2 mL，過濾膜（0.45 μm）上機(jī)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 相同濃度不同方法色譜圖對比

將標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測試，10 μg·mL-1濃度點(diǎn)優(yōu)化后的色譜圖相較標(biāo)準(zhǔn)方法明顯沒有干擾峰，更有利于目標(biāo)物的定性。10 μg·mL-1濃度點(diǎn)優(yōu)化后的方法和標(biāo)準(zhǔn)方法色譜圖如圖1所示。

圖1 10 μg·mL-1濃度點(diǎn)優(yōu)化后的方法和標(biāo)準(zhǔn)方法色譜圖（上圖為優(yōu)化方法，下圖為標(biāo)準(zhǔn)方法）

2.2 定量限的確定

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.247—2016[3]中的計(jì)算公式，當(dāng)定量限為 0.2 mg·kg-1時(shí)，檢測濃度為 0.2 μg·mL-1，信噪比為64.2，大于10符合要求。定量限檢測濃度0.2 μg·mL-1色譜圖如圖 2 所示。

圖2 定量限檢測濃度0.2 μg·mL-1色譜圖

2.3 回收率測定

取蝦油蘿卜按1.2.3試驗(yàn)過程進(jìn)行前處理，上機(jī)測試空白值為 0 μg·mL-1，同時(shí)在定量限、5 倍定量限和醬腌菜紐甜限量值0.01 g·kg-13個(gè)點(diǎn)做加標(biāo)，被測組分含量分別為 0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1，回收率分別為88.2%、91.4%、94.1%，分別滿足GB/T 27404—2008[5]中80%～110%、80%～110%、90%～110%的要求。

2.4 校準(zhǔn)曲線

上述標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)按照1.2.1的色譜條件上機(jī)測試，得出的R2為0.999 9，滿足GB/T 27404—2008[5]中R2不應(yīng)低于0.99的要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

以實(shí)驗(yàn)室變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）來反應(yīng)精密度的好壞。CV越小精密度越好，CV越大精密度越差。上述試驗(yàn)3個(gè)加標(biāo)回收樣品，折回收率實(shí)際值分別為 0.176 μg·mL-1、0.914 μg·mL-1、9.410 μg·mL-1，按照1.2.1 的色譜條件各重復(fù)進(jìn)樣7次，結(jié)果見表1。

由表1可知，上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)加標(biāo)回收樣品連進(jìn)7針實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（CV）值均小于5%，滿足GB/T 27404——2008要求。

表1 不同濃度精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（單位：μg·mL-1）

3 結(jié)論

采取磷酸氫二銨溶液、乙腈作為流動(dòng)相和等度洗脫方式，目標(biāo)物的干擾峰消失，解決了實(shí)際工作中定性的問題。同時(shí)，對優(yōu)化的方法進(jìn)行方法確認(rèn)，試驗(yàn)結(jié)果表明定量限濃度信噪比為64.2，大于10符合要求；被測組分含量分別為 0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1回收率分別為88.2%、91.4%、94.1%，均滿足GB/T 27404—2008回收率的要求；R2為0.999 9，滿足GB/T 27404—2008相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99的要求；3個(gè)加標(biāo)回收樣品連進(jìn)7針CV值小于5%，精密度滿足GB/T 27404-2008要求。優(yōu)化的方法既排除了目標(biāo)物干擾問題，也因?yàn)榱姿釟涠@作為實(shí)驗(yàn)室常用流動(dòng)相可參與檢測多個(gè)物質(zhì)而有效提高工作效率。