高效液相色譜法測定糕點中脫氫乙酸的不確定度評定

黃 潮，劉 婷

（萍鄉市食品藥品檢驗所，江西萍鄉 337000）

糕點的主要原料有谷類、薯類、豆類、糖、蛋和油脂等，經過一系列調制、烹制，這些原料最終成為美味的食物。為了獲得更好的口感，人們在熟制糕點前后還經常向糕點中添加果醬、牛奶、可可與奶油等材料。

脫氫乙酸是當下較為常見的一種食品防霉防腐保鮮劑。目前，該材料的安全性已經被聯合國糧農組織、世界衛生組織認可。這種物質能夠在水溶液中逐步降解，且在這一過程中產生抑制與延緩肝癌的作用。即便是人體皮膚長期接觸這一物質，也不會產生損傷。在實際應用中，這一物質并不會影響食物的口感，因此該物質常常被應用到糕點制作中[1]。脫氫乙酸以固態形式最為常見，呈無色結晶或淡黃色粉末，是一種低毒、高效的防腐、防霉劑。在酸、堿條件下均有一定的抗菌作用，尤其對霉菌的抑制作用最強，其化學名稱為3-乙酰基-6-甲基-脫(2),4-脫(3)氫二酮，分子式為C8H8O4。根據《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中規定糕點的脫氫乙酸最大使用量為0.5 g·kg-1（以脫氫乙酸計）。新國標GB 5009.121—2016中指出應用于食品領域的脫氫乙酸測定標準于2017年3月1日代替《食品中脫氫乙酸的測定》（GB/T 5009.121—2003）規定脫氫乙酸檢測方法第一法為氣相色譜法，第二法為液相色譜法。本文采用第二法高效液相法測定糕點中脫氫乙酸的含量，利用氫氧化鈉溶液將試樣內所含的脫氫乙酸提取出來，并采用脫脂與去蛋白的處理措施，過膜后借助紫外或二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀加以測定，根據色譜峰的留存時長來定性，運用外標法來進行定量。

由于脫氫乙酸的使用廣泛，檢測過程中遇到的問題也越來越多。如果檢測結果接近國家規定限量值，會對判斷樣品的合格性帶來困擾。在這種狀況下，明確檢測結果的不確定度非常關鍵。不確定度是一種直接與測量結果相關的參數，能夠呈現出被測出量值的分散度。依據《檢驗檢測機構資質認定能力評價 檢驗檢測機構通用要求》（RB/T 214—2017）內的相關內容可知，檢驗檢測機構應該構建起數學模型，并給出與其自身檢驗檢測能力相對等的評定測量不確定度案例[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市面上銷售的包裝寫有脫氫乙酸的糕點12份，樣品編號為1—12；甲醇（CH4O），色譜純；乙酸銨（C2H6O2N），優級純；氫氧化鈉（NaOH），分析純；正己烷（C6H14），分析純；甲酸（CH2O2），分析純；硫酸鋅（ZnSO4·7H2O），分析純。

1.2 儀器與設備

Waters2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司；分析天平（感量為0.1 mg和1 mg）；粉碎機；不銹鋼高速均質器；超聲波清洗器（功率35 kW）；渦旋混合器；離心機（轉速＞4 000 r·min-1）；pH計；C18固相萃取柱：500 mg，6 mL（使用前用5 mL甲醇、10 mL水活化，使柱子保持濕潤狀態）。

1.3 檢測方法[3]

參照國家標準《食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）測定糕點中脫氫乙酸的含量。樣品參照第二法液相色譜法進行測定[3]。

1.3.1 樣品制備

糕點用粉碎機制成粉末。

1.3.2 脫氫乙酸提取

參照國家標準《食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）第二法液相色譜法12.1.3面包、糕點、焙烤食品餡料、復合調味料測定，過0.45 μm有機濾膜，供高效液相色譜進行測定。

1.3.3 脫氫乙酸標準曲線

（1）脫氫乙酸（1.0 mg·mL-1）標準儲備液。脫氫乙酸標準品精密（精確至0.000 1 g）稱取0.100 0 g于100 mL容量瓶中，用10 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解，用水定容。4 ℃保存，3個月有效。

（2）脫氫乙酸標準工作液。分別吸取脫氫乙酸標準儲備液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL和10.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，配制成濃度分別為 1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和 100.0 μg·mL-1標準工作液，4 ℃保存，1個月有效。

1.4 數學模型

脫氫乙酸含量的計算公式為

式中：x為試樣中脫氫乙酸的含量，g·kg-1；v為最終定容的體積，mL；c1為試樣溶液內含脫氫乙酸的質量濃度，μg·mL-1；c0為空白試樣內含脫氫乙酸的質量濃度，μg·mL-1；m為樣品質量，g；f為過固相萃取柱換算系數（f=0.5）。

計算結果以重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值標識，計算結果保留兩位有效數字。

2 結果與分析

2.1 分析不確定度的來源

通過測量及建模分析可知，對脫氫乙酸含量測定的不確定度產生影響的因素主要有以下幾個方面[4]。①前期對影響因子進行處理時的相對標準不確定度ur(f),如測量過程中儀器自身的不穩定性、前期處理時或其他方面產生的影響。②實驗人員標準溶液校準的相對標準不確定度ur(c)，這是標準曲線的非線性造成的結果。③體積方面產生的相對標準不確定度ur(v)。該方面主要包括量具本身的誤差、溫濕度與人員等方面的影響。④質量的相對標準不確定度ur(m)。這一方面主要是由操作人員及天平在測量質量的過程中造成的結果。⑤重復性實驗引入的相對標準不確定度ur(R)。

2.2 計算不確定度分量

2.2.1 樣品稀釋移取過程引入的相對標準不確定度ur(f)

（1）器具校準引入的相對標準不確定度ur(f1)。25 mL B級容量瓶定容，該器具的允差應控制在0.06 mL內；10 mL A級單線移液管，該器具的允差應控制在0.02 mL內，由此可知因量器校準產生的相對標準不確定度為

（2）樣品稀釋移取過程中人員讀數引入的相對標準不確定度ur(f2)。實驗移取過程中，按照三角分布考慮，液體用量體積v的記錄，當實驗操作員讀數允許約1%的不準確性（即0.01v），那么每次相對不確定度為人員讀數使用玻璃量器兩次，由實驗員讀數引入的相對標準不確定度為因此樣品稀釋移取過程中引入的相對標準不確定度為

2.2.2 標準溶液校準產生的相對標準不確定度ur(c)

（1）標準物質引入的標準不確定度ur(c1)。根據查閱脫氫乙酸批號為7700800證書，脫氫乙酸不確定度為0.5%，按照矩形分布，其相對標準不確定度為

（2）標準物質稱量引入的相對標準不確定度ur(c2)。查閱電子天平檢定證書，根據國家標準《食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）規定，稱取0.100 0 g脫氫乙酸標準品的允差應在0.000 5 g內，考慮均勻分布：天平的重復性誤差應控制在0.000 1 g內5.77×10-5g，稱量而產生的標準不確定度u(c2)=因此，相對標準不確定度為

（3）工作曲線配制過程中引入的相對標準不確定度ur(c3)

工作曲線標準溶液配制過程根據表1玻璃量器的不確定度[5]均勻分布計算，移液器不確定度按照正態分布計算，其相對標準不確定度為

表1 玻璃量器引入的不確定度

（4）標準工作溶液配制過程中人員讀數引入的相對標準不確定度ur(c4)。按照三角分布考慮，液體用量體積v的記錄，當實驗操作員讀數允許約1%的不準確性（即0.01v），那么每次相對不確定度為共讀數6次，因此其相對標準不確定度

由于上述標準溶液校準引入的4個不確定度是單獨存在的，因此標準溶液校準引入的相對標準不確定度為

（5）標準曲線擬合引入的相對標準不確定度ur(P)。以脫氫乙酸濃度（cμg·mL-1）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線=3.182 692×104×c-6.147 225×104，R2=0.999 7。對樣品重復測量兩次，測得脫氫乙酸的濃度為cx=20.33 μg·mL-1。標準曲線擬合相關數據見表2。

表2 標準曲線擬合相關數據

代入上述數值，得u(P)=1.66。因此，標準曲線的相對標準不確定度ur(P)=0.012。

（6）樣品和標準工作峰面積引入的相對標準不確定度ur(a)。依據質管科waters高效液相色譜儀的近期檢定證書可知，其定量重復性是0.3%，依照三角分布可知，不確定度是由于ur(c)，ur(a)，ur(P)分別為各自不相關的量，因此由標準溶液校準引入的相對標準不確定度為

2.2.3 樣品稱量引入的相對標準不確定度ur(m)

稱取樣品5.017 8 g，天平最大允差為0 g，天平重復性誤差為0 g，其不確定度分別為稱量引入的標準不確定度為u(m)=則相對標準不確定度ur(m)=

2.2.4 定容體積引起的相對標準不確定度ur(v)

樣品經提取凈化后，用1 mL移液器取1 mL流動相定容。

（1）定容量器引入的不確定度。1 mL移液器的最大允差為0.002 mL，按均勻分布，其標準不確度為

（2）定容量器讀數引入的不確定度。由上可知，由實驗操作員定容產生的u(v2)=0.004 08 mL，因此相對標準不確定度為

2.2.5 重復性實驗的相對標準不確定度ur(R)

（1）重現性的不確定度。對樣品進行10次平行樣的重復上機測試，測量數據見表3。

表3 糕點中脫氫乙酸含量測定值

測定結果的標準偏差及相對不確定度為

因此，由重復性實驗引入的相對標準不確定度為1.24/256.5=0.004 8

（2）回收率的不確定度。樣品采取10次平行樣加標回收測試，回收率數據見表4。

表4 樣品中脫氫乙酸甲標回收率（單位：%）

由表4可知，其平均加標回收率為86.03%，標準偏差為0.30%。因此，回收率引入的相對標準不確定度是0.30/86.03=0.003 5。

因此，重復性產生的相對標準不確定度為

2.3 相對標準不確定度的合成及擴展

2.3.1 合成標準不確定度

各相對標準不確定度結果見表5。

表5 相對標準不確定度一覽表

將表5中各不確定度合成為

2.3.2 擴展不確定度評定

脫氫乙酸含量為256.5 mg·kg-1，則測量結果的合成標準不確定度為uc(x)=256.5×0.009 5=2.436 75 mg·kg-1。擴展不確定度可由合成標準不確定度乘以包含因子，取置信水平95%，包含因子k=2，可知糕點中脫氫乙酸測定的相對擴展不確定度為U=u（x）×k=4.873 5 mg·kg-1。

2.3.3 測量不確定度報告

樣品中脫氫乙酸含量的測定結果為（256.5±4.873 5）mg·kg-1，k=2。

3 結論

本研究參照國家標準《食品安全國家標準食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）測定糕點中脫氫乙酸的含量，樣品參照第二法液相色譜法進行測定，并依據由國家質量監督檢驗檢疫總局發布的《測量不確定度評價與表示》（JJF 1059.1—2012），綜合檢驗的各項標準與構建的數學模型，借助waters高效液相色譜儀對糕點中脫氫乙酸的結果進行不確定度評定，對不確定影響因素展開研究，針對測量過程中多項影響因素帶來的不確定度展開分析與評價。在本次研究中涉及的影響因素包括實驗環境、常用器皿、人員操作、儀器的穩定性與精密度等。其中，儀器不穩定、前處理和其他因素影響以及稱量過程中人員和天平是對實驗結果產生影響的主要方面。因此，實驗時應對標準品配制中的準確性提出更高的要求，質管科應定期檢定儀器與設備的精密程度與穩定性，以季度為周期核查好相關內容，使儀器能滿足實驗需要。同時，在實驗過程中保持實驗環境的一致性，在日常檢驗過程中重視實驗人員的操作能力與操作的規范性，降低人為操作不佳帶來的不利影響，從而使檢測結果更準確。