關于食品中亞硝酸鹽測定方法標準曲線線性范圍的探討

楊 凱，郝夢甄

（1.平邑縣檢驗檢測中心，山東平邑 273300；2.萊西市檢驗檢測中心，山東萊西 266600）

亞硝酸鹽是一種常用的食品添加劑，主要起到防腐保鮮、提高熟肉制品的色澤和延長腌制食品保質期的作用，在腌臘肉制品類、西式火腿、醬鹵肉制品和肉灌腸類等食品中常被使用[1-2]。但食用過量的亞硝酸鹽會引起中毒甚至導致死亡，研究表明成人攝入0.2～0.5 g即可引起中毒，3 g即可致人死亡[3]。很多食品企業以及食品小作坊生產者對亞硝酸鹽的使用量沒有正確的認識，因此加強食品中亞硝酸鹽含量的檢測十分重要。

《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中分光光度法測定食品亞硝酸鹽含量使用的標準曲線線性范圍窄，檢測亞硝酸鹽含量高的食品時會超出標準曲線線性范圍，只能通過稀釋原樣品的濃度再次重復實驗，這會造成實驗效率低下，浪費實驗試劑。因此，本文采用增大吸取標準溶液體積和提高標準溶液濃度兩種方法擴大標準曲線線性范圍，驗證兩種方法的可行性，以提高工作效率，減少試劑的浪費。

1 國標中分光光度法測定食品中亞硝酸鹽存在的不足

1.1 標準曲線線性范圍窄

《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中使用的標準溶液濃度為5 μg·mL-1，標準曲線的最大吸取體積是2.5 mL，按照稱樣質量5.0 g計算，得到該標準曲線最高點的亞硝酸鹽含量為12.5 mg·kg-1[4]。但《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中規定，腌臘肉制品類、醬鹵肉制品和肉灌腸類等的亞硝酸鹽限量為30 mg·kg-1，西式火腿的亞硝酸鹽限量為70 mg·kg-1，該標準曲線的線性范圍不能滿足日常食品中亞硝酸鹽含量的檢測[5]。

1.2 標準曲線的吸光度值偏低

物質吸光的定量依據為朗伯-比爾定律：A=kcL，當吸光度A=0.434時，吸光度測量誤差最小[6]。如果要求測量誤差小于5%，則吸光度值A=0.050～1.500；測量誤差小于2%，則吸光度值A=0.155～0.950[6]。但《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中標準曲線各點對應的吸光度值為0、0.012、0.027、0.039、0.054、0.069、0.104、0.141和 0.173， 表 明亞硝酸鹽的標準曲線不在最佳線性范圍內，這將造成較大實驗誤差。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

亞硝酸鈉標準溶液（1 000 μg·mL-1，北京北方偉業計量技術研究院，編號：BWZ6967-2016）；乙酸鋅；對氨基苯磺酸；亞鐵氰化鉀；硼酸鈉；鹽酸萘乙二胺。

分光光度計（TU-1810）；分析天平（FA2004）；電熱恒溫水浴鍋（LKTC-B1）。

2.2 實驗方法

2.2.1 國標法

標準曲線使用濃度 （ρNaNO2）=5.0 μg·mL-1（以亞硝酸鈉計），吸取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL 和2.50 mL亞硝酸鈉標準使用液，分別置于50 mL比色管中。于各管中分別依次加入對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液，加水至50 mL刻度，混勻，靜置15 min，用1 cm比色杯，以零管調節零點，于波長538 nm處測吸光度，繪制標準曲線[4]。

2.2.2 改進法一

標準曲線使用濃度 （ρNaNO2）=5.0 μg·mL-1（以亞硝酸鈉計），吸取0 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL、12.00 mL和14.00 mL亞硝酸鈉標準使用液，分別置于50 mL比色管中。對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液加入順序、加入量、混勻后靜置時間以及測量波長等條件均與2.2.1國標法完全相同。

2.2.3 改進法二

標準曲線使用濃度 （ρNaNO2）=25.0 μg·mL-1（以亞硝酸鈉計），吸取0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00 mL、2.40 mL 和2.80 mL亞硝酸鈉標準使用液，分別置于50 mL比色管中。對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液加入順序、加入量、混勻后靜置時間以及測量波長等條件均與2.2.1國標法完全相同。

3 結果與分析

3.1 標準曲線

橫坐標為標準系列溶液中亞硝酸鈉的質量（μg），縱坐標為對應的吸光度值，繪制標準曲線，如圖1和圖2所示。國標法的線性方程為y=0.014x-0.001 5，相關系數R2=0.999 6；改進法一的線性方程為y=0.012 5x+0.013 6，相關系數R2=0.999 0；改進法二的線性方程為y=0.012 6x+0.013 2，相關系數R2=0.999 0。通過相關系數可以看出，國標法、改進法一、改進法二線性關系良好，符合實驗要求。

圖1 國標法亞硝酸鈉的質量與吸光度的標準曲線圖

圖2 改進法一和改進法二亞硝酸鈉的質量與吸光度的標準曲線圖

3.2 回收率的測定

隨機取一實驗用樣品，用國標法、改進法一和改進法二分別重復實驗，測得樣品中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計，下同）的質量分別為1.893 μg、1.872 μg、和1.889 μg。取上述實驗用樣品，加入3種不同亞硝酸鹽含量的標準溶液進行加標回收實驗，國標法、改進法一和改進法二對每個加標實驗重復測量7次，計算回收率和相對標準偏差。

由表1、表2、表3可知，國標法測得回收率為89.0%～99.0%，相對標準偏差為1.53%～2.56%；改進法一測得回收率為88.9%～96.0%，相對標準偏差為1.38%～2.56%；改進法二測得回收率為88.5%～96.5%，相對標準偏差為1.18%～3.02%。結果表明，改進法一和改進法二的加標回收率均符合要求，數據穩定性好。

表1 國標法回收率的測定

表2 改進法一回收率的測定

表3 改進法二回收率的測定

3.3 準確度和精密度的測定

將不同濃度的亞硝酸鈉標準溶液使用國標法、改進法一和改進法二分別重復測量7次，比較所測得結果的準確度和精密度。由表4、表5可知，國標法測得結果的準確度為-3.32%～2.55%，精密度為1.55%～3.60%；改進法一測得結果的準確度為-2.90%～2.58%，精密度為0.73%～2.27%；改進法二測得結果的準確度為-2.13%～2.06%，精密度為0.69%～2.55%。結果表明，改進法一和改進法二的準確度、精密度均符合要求。

表4 國標法準確度和精密度的測定

表5 改進法一、改進法二準確度和精密度的測定

3.4 國標法和改進法的顯著性檢驗

用國標法、改進法一和改進法二分別對某實驗樣品中亞硝酸鹽含量進行檢測，結果見表6。所測得的數據用軟件SPSS 21.0進行顯著性檢驗，計算顯示，國標法與改進法一的P值為0.594＞0.05；國標法與改進法二的P值為0.301＞0.05。結果表明，與國標法相比較，改進法一、改進法二所測得數據無顯著性差異，符合要求。

表6 3種檢測方法的檢測結果

4 結論與討論

本文通過實驗將《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）測定食品中亞硝酸鹽含量標準曲線的線性范圍擴大，以滿足實驗室的日常使用。結果顯示，改進法一、改進法二與國標法檢測結果無顯著性差異，且改進法一、改進法二的準確度、精密度、回收率均符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求[7]。因此，可通過增大吸取標準溶液體積或提高標準溶液濃度的方法擴大標準曲線的線性范圍，從而提高工作效率，減少試劑的浪費。