高效液相色譜法測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的不確定度評定

王 露，李曉偉，馮培培，趙素勤，王繼美

（河南中標檢測服務有限公司，河南鄭州 450000）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA），又稱F-2毒素，是由鐮刀菌屬菌株產生的代謝產物，廣泛存在于霉變玉米等谷物作物中，會導致畜禽出現生殖、免疫疾病，造成畜牧企業(yè)的經濟損失。同時還可以通過被污染的谷類作物和動物性食品進入人體，誘發(fā)腫瘤和產生免疫疾病，給人類健康造成極大的危害[1-2]。目前世界上70%～75%玉米的用途是制作飼料，確定玉米赤霉烯酮的含量是評估飼用玉米優(yōu)劣的重要依據。我國GB 13078—2017[3]規(guī)定，飼用玉米玉米赤霉烯酮含量不得超過0.5 mg·kg-1。目前玉米赤霉烯酮的測定方法主要有酶聯免疫吸附法、液相色譜串聯質譜法和高效液相色譜法等[4]。本文嚴格按照《飼料中玉米赤霉烯酮的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》（GB/T 28716—2012）[5]操作，依據《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL 006：2019）[6]的規(guī)定，對其檢驗結果的不確定度進行評估，為實驗室出具的玉米赤霉烯酮檢測結果的準確性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為某公司送檢的飼用玉米粒，實驗室制備樣品完全通過1 mm試驗篩；玉米赤霉烯酮標準物質溶液（濃度為 100.0 μg·mL-1）。

甲醇、乙腈（HPLC級）；氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀（分析純）；一級水；玉米赤霉烯酮免疫親和柱；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，無熒光特性）。

1.2 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀配有熒光檢測器；多管渦旋振蕩器；水浴式氮吹儀；粉碎機；高速冷凍離心機；pH計；電子天平；玻璃器皿；移液器。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

（1）玉米赤霉烯酮標準中間液（10 μg·mL-1）。用移液器準確移取1 mL玉米赤霉烯酮標準物質（100 μg·mL-1）置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。

（2）玉米赤霉烯酮系列標準工作液。用移液器將玉米赤霉烯酮標準中間液準確移取到容量瓶（10 mL）中，用80%乙腈水溶液稀釋定容至刻度，得到20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1以及500 ng·mL-1的系列標準工作液。

1.3.2 樣品處理

（1）提取。在250 mL具塞錐形瓶中，用百分之一天平稱取40 g樣品，加入4.0 g NaCl，80%乙腈水溶液100 mL，振蕩0.5 h，過濾后用移液器移取濾液10.0 mL，再加入PBS溶液40.0 mL，用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，備用。

（2）凈化（按廠家說明執(zhí)行）。在免疫親和柱上端連接10 mL注射器；移取10 mL濾液，以1～2滴/s的速度通過免疫親和柱；加5 mL水淋洗柱子一次，棄掉流出的液體；用注射器吹干柱中水；加入2 mL甲醇以2～3滴/s的速度洗脫；將收集洗脫液55 ℃氮氣吹干，用2 mL提取液（乙腈+甲醇+水，46+46+8）復溶，混勻，過0.45 μm濾膜，備用。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：45%乙腈+46%甲醇+8%水；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：激發(fā)波長274 nm；發(fā)射波長440 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 數學模型

根據測定原理及方法，試樣中玉米赤霉烯酮含量按式（1）計算。

式中：Pi為試樣溶液峰面積值；V為樣品的總稀釋體積，mL；cst為標準溶液濃度，ng·mL-1；Vst為標準溶液進樣體積，μL；Pst為標準溶液峰面積平均值；m為試樣質量，g；Vi為試樣溶液進樣體積，μL。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據測定過程和數學模型分析，影響玉米中玉米赤霉烯酮含量的測量不確定度的因素有：①標準溶液的配制；②標準曲線的擬合；③回收率測定；④重復性測定；⑤樣品稱量；⑥樣品的前處理操作；⑦高效液相色譜儀。

2.2 不確定度的量化與評定

2.2.1 標準溶液配制引入的相對不確定度urel-s

（1）標準物質純度引入的相對不確定度urel-s1。玉米赤霉烯酮標準物質溶液的濃度為c=100 μg·mL-1（證書），U=1.2 μg·mL-1（k=2），則標準物質溶液引入的相對標準不確定度為

（2）標準系列工作液配制引入的相對不確定度urel-s2。該過程使用了10 mL容量瓶、20～200 μL可調移液槍和100～1 000 μL可調移液槍，按照JJG 196—2006[7]和JJG 646—2006[8]的要求，用最大允差計算不確定度，按照矩形分布考慮(表 1)。標準系列工作液配制引入的相對不確定度為

表1 配制標準溶液時移液器引入的不確定度

2.2.2 標準曲線擬合引入的相對不確定度urel-st

將配制玉米赤霉烯酮系列標準工作液的5個濃度點分別注入高效液相色譜儀，各進行2次平行測定（n=10），標準工作液濃度平均值為測定結果見表2。

采用最小二乘法擬合，繪制標準曲線。以標準工作液濃度為橫坐標（X），峰面積平均值為縱坐標（Y），回歸方程為Y=229.44X+997.63（a=229.44，b=997.63），線性相關系數R2=1.000 0。根據表2可以計算出標準曲線的標準偏差SR=207.994與偏差平方和SX=303 040。

表2 標準曲線各濃度的峰面積測定值（n=10）

樣品重復測定6次（q=6），將測定的峰面積代入線性回歸方程計算樣品溶液的濃度X樣，結果分別為 74.98 ng·mL-1、75.92 ng·mL-1、75.75 ng·mL-1、78.08 ng·mL-1、75.43ng·mL-1和 77.23 ng·mL-1，樣液濃度平均值

綜上所述，標準曲線擬合引入的標準不確定度為

因此，由標準曲線擬合引入的相對不確定度為

2.2.3 回收率引入的相對不確定度urel-rec

向樣品中加標，添加量為50 μg·kg-1，通過前處理，并對樣品進行了6次平行測定（n=6）。根據測定的峰面積，計算得到加標回收率分別為93.3%、94.1%、93.6%、94.8%、96.3%和95.2%，平均值為按照貝塞爾公式計算樣品加標回收率的標準偏差為S=1.114 9。

2.2.4 重復性測定引入的相對不確定度urel-p

根據上述樣品溶液濃度的測定結果，計算出樣品中玉米赤霉烯酮含量C（in=6），結果為187.45 μg·kg-1、189.80 μg·kg-1、189.38 μg·kg-1、195.20 μg·kg-1、188.58 μg·kg-1和 193.08 μg·kg-1，樣液濃度平均值：計算出樣品重復性測定的標準偏差(貝塞爾公式)

2.2.5 樣品稱量引入的相對不確定度urel-m

根據國標要求，使用百分之一天平稱取40.0 g樣品，證書顯示該天平的擴展不確定度U=0.01 g（k=2）。因此樣品稱量引入的不確定度um=0.005 g，其相對不確定度為urel-m=0.005÷40.0=0.000 125。

2.2.6 樣品前處理引入的相對不確定度urel-d

在樣品的前處理中，使用了100 mL的量筒1次，其最大允差為±1.0 mL；使用了50 mL的量筒1次，其最大允差為±0.5 mL；使用了2～10 mL的移液器2次，其最大允差為±0.12%；使用1 000 μL移液器4次，其最大允差為±1.0%。按照矩形分布考慮（），樣品提取引入的相對不確定度為

2.2.7 高效液相色譜儀操作引入的相對不確定度urel-h

使用的高效液相色譜儀，經證書查得其測量結果的擴展不確定度為6%（k=2），則高效液相色譜儀操作引入的相對不確定度為

2.3 合成不確定度ur

將各個不確定度分量及其評定結果匯總于表3，并對其進行合成，得到相對合成不確定度為

表3 相對不確定度匯總表

綜上所述，飼用玉米中玉米赤霉烯酮(高效液相色譜法測定)的合成不確定度ur=0.056 060×76.23=4.273 45 μg·kg-1。。

2.4 擴展不確定度U

采用正態(tài)分布分析，P=95%，k=2，可得到高效液相色譜法測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的擴展不確定度為U=k×ur=8.55 μg·Kg-1。

高效液相色譜法測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的結果可表示為C=（76.23±8.55）μg·kg-1，置信水平P=95%。

3 結論

依據GB/T 28716—2012測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的含量，通過對各個不確定度分量的分析，其中標準溶液的配制和高效液相色譜儀的操作是影響不確定度的因素中占比最大的，分別為30.489 6%和24.437 3%，而樣品稱量引入的相對不確定度幾乎可以忽略不計。因此，在實驗室采用該方法對飼用玉米進行檢測時，要在配制標準溶液時選擇精密度高的計量器具，保證標準溶液配制的準確度，同時需要定期開展檢定校準，保證計量器具和高效液相色譜儀精密性和穩(wěn)定性，減小不確定度分量，保證檢測數據的準確性和合理性[9]。