超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中氧氟沙星殘留量的不確定度評定

鄭陸紅，張慧瓊，陳 茹

（1.廣東省食品工業研究所有限公司，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業公共實驗室，廣東廣州 511442；3.廣東省食品質量監督檢驗站，廣東廣州 511442）

氧氟沙星是一種人工合成抗菌藥物，具有抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強和價格低廉等優點，被廣泛應用于畜牧、水產等養殖業中水產動物的疾病預防與治療[1-5]。氧氟沙星易殘留于動物組織，通過食物鏈循環進入人體，形成耐藥性，長期食用含有該藥物殘留的食品，可危害人類健康[6-7]。2015年我國農業部第2292號公告[8]規定水產品中不得使用氧氟沙星。近年來，國家市場監督管理總局食品安全監督抽檢中關于食用農產品涉及的水產品項目中喹諾酮類獸藥殘留超標的通告較多[9-12]，其中氧氟沙星項目占據較大比例。因此，檢測水產品中氧氟沙星藥物的含量非常有必要。

食品檢驗過程會受到諸多不確定因素的影響，導致實驗結果與真值之間存在一定的誤差[13-14]。為了保證檢測結果的準確性，真實反映被測量估計值的不確定度，需要對不確定度進行測量與分析。測量不確定度一般由若干個分量組成，表征賦予被測量值分散性的非負參數[15-16]。測量不確定度用于判斷測量結果的可靠程度，檢測過程中影響結果的不確定度來源及影響程度[17]。本文依據《化學分析中不確定度的評估指南》及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[18-19]，結合《水產品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（農業部1077號公告—1—2008）對水產品中氧氟沙星殘留量的不確定度進行測量與分析，評定測量不確定度[20]。通過對其進行不確定度評定，分析檢測過程中的不確定度來源及各分量對實驗結果的影響程度，為控制及減少實驗過程中所產生的不確定度提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水，一級水；甲醇、乙腈、醋酸銨和甲酸，均為色譜純；無水硫酸鈉（650 ℃灼燒4 h，冷卻后貯于密閉容器中備用）；氧氟沙星標準品（CAS號：82419-36-1，純度≥95.71%）；諾氟沙星-D5標準品（CAS號：1015856-57-1，純度≥99.7%）；液相色譜-串聯四極桿質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；分析天平；渦旋混合器；超聲波清洗儀；離心機；均質器；旋轉蒸發儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理過程

①稱取5 g樣品于50 mL離心管中，準確加入50 μL 諾氟沙星 -D5（1 μg·mL-1）內標標準工作液，渦旋混勻，避光放置10 min。②加入10 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，再加入20 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，渦旋混合1 min，超聲波提取10 min，離心，移取上清液。③殘渣中再加入20 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，重復提取1次。④合并兩次提取液于40 ℃水浴中氮氣吹干。⑤加1.0 mL 20%甲醇溶解殘留物，再加入2.0 mL正己烷渦旋混合，轉入5 mL離心管中，離心，取下層清液過0.22 μm濾膜后供UHPLCMS/MS分析測定。

1.2.2 標準工作液配制

氧氟沙星標準儲備液：準確稱取10.53 mg氧氟沙星，用乙腈溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到濃度為1 008 μg·mL-1的氧氟沙星標準儲備液。

諾氟沙星-D5內標標準儲備液：準確稱取4.92 mg諾氟沙星-D5，用甲酸+甲醇（2+98）溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到濃度為491 μg·mL-1的諾氟沙星-D5內標標準儲備液。

氧氟沙星標準中間液：吸取0.05 mL氧氟沙星標準儲備液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到濃度為1.008 μg·mL-1的氧氟沙星標準中間溶液。

諾氟沙星-D5內標標準中間液：吸取0.11 mL諾氟沙星-D5標準儲備液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到濃度為1.08 μg·mL-1的諾氟沙星-D5標準中間溶液。

氧氟沙星標準工作液：準確移取氧氟沙星標準中間液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和0.50 mL諾氟沙星-D5內標標準中間液于10 mL A級容量瓶中，用20%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。氧氟沙星標準工作液濃度分別為 5.04 ng·mL-1、10.08 ng·mL-1、20.16 ng·mL-1、50.40 ng·mL-1和 100.80 ng·mL-1，諾氟沙星-D5內標濃度為54.0 ng·mL-1。

1.2.3 色譜條件

色 譜 柱：phenomenex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫：40 ℃，流動相：A為0.1%甲酸水、B為甲醇，流速：0.3 mL·min-1，進樣量：1 μL。梯度洗脫程序：0～0.50 min，90%A；0.50～5.00 min，90%A～ 10%A；5.00～ 6.00 min，10%A；6.00～6.01 min，10%A～90%A；6.01～7.00 min，90%A。

2 結果與分析

2.1 數學模型

樣品中氧氟沙星殘留量采用標準曲線法及同位素內標法定量，定量結果計算公式為

式中：X為試樣中氧氟沙星的殘留量，μg·kg-1；C為從標準工作曲線上得到的被測組分濃度，ng·mL-1；V為試樣最終定容體積，mL；W為樣品質量，g。

2.2 不確定度來源分析

超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）測定水產品（魚）中氧氟沙星殘留量的不確定度來源主要有標準工作液配制過程中產生的不確定度、定容體積產生的不確定度、樣品稱量過程中產生的不確定度、樣品進行重復測定產生的不確定度、最小二乘法擬合標準曲線產生的不確定度以及超高效液相色譜-串聯質譜儀引入的不確定度等。

不同的因素及其影響見圖1。

圖1 UHPLC-MS/MS法測定水產品中（魚）氧氟沙星的不確定度來源圖

2.3 標準不確定度分量評定

2.3.1 配制標準工作液產生的相對標準不確定度urel,1(S)

（1）配制氧氟沙星標準物質引起的相對標準不確定度urel,2(P)。查閱氧氟沙星標準物質證書可知，其擴展不確定度為0.46%（k=2），純度為95.71%，則其相對標準不確定度平方為[0.46%÷(2×95.71%)]2=5.775×10-6。

標準曲線所用內標溶液與試樣溶液所用內標溶液為同一溶液且加入的量一致，因此配制諾氟沙星-D5內標溶液過程中稱樣量、稀釋體積及純度的不確定度的分量可忽略不計，只考慮內標溶液取樣體積引入的不確定度。

（2）標準物質稱量引起的相對標準不確定度urel,3(m1)。氧氟沙星標準物質是由十萬分之一電子天平進行稱量。根據電子天平檢定證書，最大允許誤差（MPE）為 ±0.05 mg，按矩形分布（）計算，稱取氧氟沙星標準物質0.010 53 g，其相對標準不確定度平方為7.516×10-6。

（3）配制標準工作液配制過程中所用器具引起的相對標準不確定度urel,4(V1)。配制氧氟沙星標準工作液過程中所用器具引起的相對標準不確定度主要來源為容量瓶定容體積、移液槍移取溶液。配制所用的容量瓶經鑒定均為A級，可按國家規范《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）規定，按三角分布計算，移液器引入的相對標準不確定度，由校準證書得到，按三角分布計算，配制氧氟沙星標準工作液過程中所用器具的最大允許誤差及相對標準不確定度的平方如表1所示。

表1 配制氧氟沙星標準工作液過程中所用器具引起的相對標準不確定度

配制氧氟沙星標準工作溶液配制過程中所用器量引起的相對標準不確定度的平方為=6.667×10-7+1.667×10-7+3.334×10-6+3.750×10-5+1.125×10-4+1.167×10-4=2.709×10-4。

（4）標準工作溶液配制過程中所用量器溫度系數引起的相對標準不確定度分量urel,5(T1)。氧氟沙星標準工作液均在（20±4）℃條件下進行配制，溶液溫度與檢定標準溫度（20 °C）不同產生了相對標準不確定度分量urel,5(T1)。可通過估算該體積膨脹系數和溫度范圍計算其引起的相對標準不確定度。液體的體積膨脹明顯大于玻璃容器體積膨脹，故只考慮前者即可。乙腈的膨脹系數為1.37×10-3℃-1，甲醇的膨脹系數為1.19×10-3℃-1，水的膨脹系數為2.1×10-4℃-1，按照矩形分布計算，配制氧氟沙星標準工作液過程中，所用器具溫度系數引起的相對標準不確定度的平方見表2。

表2 配制氧氟沙星標準工作液過程中所用器具溫度系數引起的相對標準不確定度

配制氧氟沙星標準工作溶液時溫度變化引入的相對標準不確定度的平方為)=1.002×10-5+7.553×10-6+1.176×10-6+7.553×10-6+7.056×10-7+1.647×10-6= 2.866×10-5。

綜上，配制氧氟沙星標準工作液產生的相對標準不確定度的平方為=5.775×10-6+7.516×10-6+2.709×10-4+2.866×10-5=3.13×10-4。

2.3.2 樣品前處理過程中產生的相對標準不確定度urel,6(Q)

（1）樣品前處理過程中稱量產生的相對標準不確定度urel,7(m)。通過查閱萬分之一的電子天平使用說明書，稱量5.000 0 g時，最大允差為0.5 mg，按矩形分布（），用該天平秤量樣品6份，得到5 023.3 mg、5 061.5 mg、5 067.2 mg、5 077.0 mg、5 051.2 mg和5 061.3 mg，方差為342.4 mg，所用校準砝碼引起的不確定度貢獻較小，忽略不計。稱取樣品產生的相對標準不確定度的平方為=(342.4÷6)+(0.52÷3)=57.15 mg。

稱取樣品質量為5.023 3 g、5.061 5 g，其平均值為5.042 4 g，產生的相對標準不確定度的平方為

（2）樣品處理過程中所用量器引入的相對標準不確定度urel,8(V3)。本方法采用內標法定量，樣品前處理時使用1 000 μL移液槍移取400 μL諾氟沙星-D5內標（1.08 μg·mL-1）加入至樣品中。使用 1 000 μL 移液槍移取1 000 μL 20%甲醇溶液進行定容。由于氧氟沙星含量超線性范圍，樣品定容后需再稀釋8倍，使用200 μL移液槍取125 μL樣液，加20%甲醇溶液定容至1.00 mL容量瓶。1 000 μL移液槍的最大容量允差為 ±10.0 μL，200 μL 移液槍最大允差為 ±3.0 μL，1 mL容量瓶的最大允差為±0.010 mL，依據三角分布，樣品處理過程中所用器量產生的相對標準不確定度平方為

（3）溫度系數引入的相對標準不確定度分量urel,12(T3)。樣品是在（20±4）℃條件下進行定容，溶液溫度與檢定標準溫度（20 °C）不同產生了相對標準不確定度分量urel,12(T3)。水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，甲醇的膨脹系數為 1.19×10-3℃-1，按照矩形分布計算（）。內標中間液主要成分是甲醇，樣品定容溶液和稀釋液的主要成分是水，樣品處理過程中溫度系數產生的相對標準不確定度平方為

綜上，樣品前處理過程中產生的相對標準不確定度urel,6(Q)的平方為2.248×10-6+8.751×10-5+8.259×10-6=9.81×10-5。

2.3.3 樣品重復性測定及標準曲線擬合產生的相對不確定度urel,17(C)

（1）樣品測量結果重復性偏差產生的相對標準不確定度分量u(X)。選用一份陽性的樣品，選取6份，經處理后，進行測定，測定結果見表3。

表3 樣品重復性測定結果（單位：ng·mL-1）

（2）標準曲線擬合的標準偏差引入的相對標準不確定度。將氧氟沙星標準系列溶液測定3次，得到氧氟沙星與諾氟沙星-D5峰面積之比，取平均值。以氧氟沙星與諾氟沙星-D5的濃度之比X為橫坐標，氧氟沙星與諾氟沙星-D5峰面積之比Y為縱坐標，進行回歸分析。用最小二乘法擬合求出一元回歸方程及相關系數，計算結果見表4。

表4 氧氟沙星標準系列溶液3次測定的結果

采用最小二乘法擬合濃度-峰面積之比的標準工作曲線，線性回歸方程為y=4.169 4x-0.173；相關系數為r=0.999 9，大于0.995，符合《實驗室質量控制規范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）標準要求，說明氧氟沙星標準系列溶液濃度與諾氟沙星-D5標準系列溶液濃度之比和氧氟沙星標準系列溶液與諾氟沙星-D5標準系列溶液峰面積之比具有顯著的線相關性。根據貝塞爾公式，標準曲線的剩余標準差SR為

式中：yij為氧氟沙星與諾氟沙星-D5峰面積之比；yi為回歸直線計算的值；n為標準工作液的點數，n=5；m為標準工作液每個測量點重復測量次數，m=3。

（3）回歸系數斜率a產生的不確定度u(a)的平方為

（4）回歸系數截距b產生的不確定度u(b)的平方為

（5）儀器測量結果產生的不確定度。u(x)、u(y)、u(a)、u(b)之間相互獨立不相關，根據公式：

氧氟沙星各分量靈敏系數為

合成標準不確定度uc(c)的平方為

樣品重復性測定及標準曲線擬合產生的相對不確定度的平方為

2.3.4 超高效液相色譜-串聯質譜儀引入的相對標準不確定度urel,18(I)

根據廣東省計量科學研究出具的儀器校準證書，液相色譜-質譜聯用儀引入的相對擴展不確定度Urel=10%，k=2，按照矩形分布得到儀器引入的相對標準不確定度的平方為

2.4 合成相對標準不確定度的評定ucrel(X)

根據含量計算公式，水產品（魚）中氧氟沙星殘留量測定的合成相對標準不確定度由標準工作液配制產生的相對標準不確定度、定容體積產生的相對標準不確定度、樣品稱量過程中所產生的相對標準不確定度、樣品進行重復性測定產生的相對標準不確定度、標準曲線擬合產生的相對標準不確定度等分量組成，結果見表5。

表5 UPHLC-MS/MS法測定黃骨魚中氧氟沙星含量測定的合成相對標準不確定度的分量

因此UHPLC-MS/MS法測定水產品（魚）中氧氟沙星含量測定的合成相對標準不確定度為

2.5 擴展不確定度的評定

當樣品中氧氟沙星的含量為 66.1 μg·kg-1，在95%置信區間，包含因子k=2，則其擴展不確定度為UP=kp×urel=2×3.78×6.1=5.0 μg·kg-1。

3 結論

當 樣品中 氧氟沙星 含量為 66.1 μg·kg-1時，取置信水平p=95%（k=2），則其結果可以表示為（66.1±5.0）μg·kg-1（k=2）。通過計算合成相對標準不確定度可得知，UHPLC-MS/MS測定水產品（魚）中氧氟沙星殘留量的實驗過程中各分量對實驗結果影響程度的大小，為評定方法及結果的準確性提供了可靠的依據。相對于樣品前處理過程中產生的相對標準不確定度，配制標準工作液引入的相對標準不確定度和儀器測量引入的相對標準不確定度對總合成相對標準不確定度影響較大。為了控制標準工作液配制工程中產生的誤差，應使用高純品的標準物質，檢定合格的器具，定期對儀器進行校準。根據實際情況選擇合適濃度的標準曲線范圍，提高檢驗員人員的操作水平，減少操作過程引入的不確定度。