茯磚茶中冠突散囊菌的檢測條件研究

劉 靜，舒 靜，秦 婧

（陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安 710048）

茯磚茶隸屬中國茶葉六大分類中的黑茶，目前盛產于陜西省涇陽縣和湖南省安化縣，其中涇陽是茯磚茶的發源地，于1368年前后形成定型的涇陽茯磚茶，如今更是陜西涇陽縣的地理標志產品[1]。

茯磚茶在發花過程中，通過控制一定的溫濕度，促進優勢菌種的生長，產生大量的金黃色的閉囊殼，俗稱“金花”，“金花”的多少是鑒別茯磚茶品質好壞的標準[2]。研究表明，“金花”在茯磚茶中繁殖時會產生大量的酶類，這些酶使原料中的纖維素、果膠質、淀粉、蛋白質、脂肪和多酚等物質分解，對改善茯磚茶的品質有著積極的作用[3]。多數學者都對茯磚茶發花中的優勢菌進行鑒定，認為冠突散囊菌是優勢菌[4-7]。2012年，丁婷等[8]也研究證明了陜西涇陽茯磚茶中優勢菌為冠突散囊菌。

檢測茯磚茶中的冠突散囊菌不僅可以評價茶葉質量，更能促進茯磚茶的良好發展，因此對冠突散囊菌進行檢測至關重要。現行的茯磚茶標準中提及冠突散囊菌的主要有《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）[9]和《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》（DBS 61/0006—2014）[10]，其中所指定的檢測方法均為《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）[11]，這個標準規定了食品中霉菌和酵母的計數方法，其中第一法適用于各類食品中霉菌和酵母的計數，第二法適用于番茄醬罐頭、番茄汁中霉菌的計數；對于冠突散囊菌的檢測并未作出詳細規定。本文針對GB 4789.15—2016中的第一法-平板計數法對冠突散囊菌的檢測細節條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

15份茯磚茶，購自陜西各超市賣場；孟加拉紅瓊脂，購自北京陸橋技術有限責任公司；霉菌培養箱；生物安全柜；拍擊式均質器；渦旋混勻儀。

1.2 方法

1.2.1 試驗方案

為了能夠做到均衡取樣，取樣方法選擇中心五點法和對角線五點法進行比較研究，其中中心五點法是在對茯磚茶的兩條對角線作四等分，分割點即為取樣點，對角線五點法則是對茯磚茶的其中一條對角線進行六等分，同樣，分割點即為取樣點；中心五點法[12]示例見圖1，對角線五點法示例見圖2。除了要考慮均衡取樣，所有樣本的均質時間也應當保持一致，均質時間選擇15 s、30 s、60 s進行比較研究，從而選擇出既能節省試驗時間又能充分均質樣品的均質時間。

圖1 中心五點法示例

圖2 對角線五點法示例

1.2.2 試驗方法

本次研究對共計15份茯磚茶樣本按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB4789.15—2016）第一法 霉菌和酵母平板計數法進行檢驗。秤取25 g樣品，加入225 mL無菌生理鹽水，用拍擊式均質器均質拍打，制成1∶10的樣品勻液。取1 mL 1∶10的樣品勻液注入一支含有9 mL的無菌生理鹽水的試管中，用渦旋混勻儀混均后制成1∶100的樣品勻液，若有需要，可重復上述步驟繼續稀釋。選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進行10倍梯度稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液分別加入2個無菌平皿中，同時分別吸取1 mL無菌生理鹽水加入兩個無菌平皿作為空白對照，及時將20～25 mL冷卻至46 ℃左右的孟加拉紅瓊脂傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻，置于水平臺面待培養基完全凝固后置于培養箱內（28±1）℃培養，觀察并記錄至第5天的結果。

2 結果與分析

2.1 取樣方法比較

對每一份樣本都稱取兩份試驗樣本，一份按照中心五點法取樣，一份按照對角線五點法進行取樣，每個取樣點取樣約5 g，總計25 g，進行標注后加入無菌生理鹽水進行10倍稀釋，所有樣本均質60 s后按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）第一法 霉菌和酵母平板計數法進行檢驗，菌落計數時，用肉眼觀察計數，冠突散囊菌在孟加拉紅瓊脂平板上生長形態為圓形、邊緣白色至鵝黃色、中心呈黃褐色、絨毛狀，也有未生長大的菌落為小的白色絨毛狀菌落。選擇計數結果在10～150 CFU的稀釋度，用平均數乘以相應的稀釋倍數即可。最終統計結果見表1。

表1 不同取樣方法的結果統計

由表1知，中心五點法取樣所測得的數據均比對角線五點法取樣所測得的數據大，原因可能是中心五點法的取樣點位置均為茯磚茶的較為中間的部位，其冠突散囊菌分布相對均勻，而對角線五點法取樣位置中有兩個取樣點比較靠近茯磚茶邊緣的部位，而邊緣部分的冠突散囊菌一般分布較少，相較而言，中心五點法更能代表樣品的真實情況。

2.2 均質時間比較

對中心五點法的試驗樣本先均質15 s后按照標準要求，取出1 mL直接進行梯度稀釋并選適宜的稀釋度進行試驗，剩余的樣本繼續均質15 s后再次按照標準要求，取出1 mL直接進行梯度稀釋并選適宜的稀釋度進行試驗，最后剩余樣本繼續均質30 s后同樣按照標準要求，取出1 mL直接進行梯度稀釋并選適宜的稀釋度進行試驗，最終得到的3份試驗樣本，即均質時間分別為15 s、30 s、60 s的試驗樣本。對所有試驗樣本按照標準進行檢測后，觀察計數后計算結果。結果統計見表2。

表2 不同均質時間的結果統計

由表2知，隨著拍擊時間的延長，所測得的冠突散囊菌數據也越來越大。均質15～30 s時，數據增幅較大，而30～60 s的數據增幅較為平緩，原因可能是15s拍擊時間過短，很多茶葉樣本還沒有得到充分的均質，冠突散囊菌沒有釋放至樣品勻液中，30 s時大多數茶葉樣本得到充分均質，從而釋放更多的冠突散囊菌至樣品均液中，60 s時拍擊時間長，茶葉樣本得到充分的均質，冠突散囊菌的釋放也逐步達到頂點；拍擊時間大于1 min時數據或許仍會有所增加，但考慮到總試驗時間不能過長、霉菌孢子容易擴散等因素，拍擊時間不宜超過1 min。

3 結論

本次研究立足陜西特色產品的檢驗，結合實際工作經驗，依據現有標準對陜西涇陽茯磚茶中冠突散囊菌的檢測條件進行研究分析，分析結果顯示中心五點取樣法較對角線五點取樣法測得的數據更大，更能代表樣本的真實情況，且隨著拍擊時間的增長，所測得的數據也會增加，但最終會趨于穩定，但考慮到總實驗時間不宜過長，孢子容易擴散等因素，均質時間不宜超過1 min。此次研究雖然樣本量采集遠遠不夠，且很多其他條件尚未摸索，但能為后續實驗條件的選擇及研究提供一定的支撐。