達格列凈對動脈粥樣硬化的影響以及與鈉氫交換體1相關機制

張書萍莫顯剛張詩悅陳舉海王 蘭楊 卉劉大男

(1.貴州醫科大學,貴陽 550004;2.貴州醫科大學附屬醫院綜合病房,貴陽 550004;3.貴州醫科大學附屬醫院心血管內科,貴陽 550004)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、腦卒中及外周動脈閉塞等血管疾病的病理基礎。AS斑塊內炎癥細胞代謝活躍,糖酵解增強,致斑塊內pH值降低,后者常導致斑塊不穩定及心血管事件發生。鈉氫交換體1(sodium-hydrogen exchanger 1,NHE1)是調節細胞及組織pH值最重要的分子之一[1],且NHE1決定AS病灶的酸化狀態并促進AS形成[2]。鈉葡萄糖協同轉運蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制劑如達格列凈、恩格列凈等主要通過抑制腎小管上皮SGLT2而減少葡萄糖重吸收發揮降糖作用[3],此外,SGLT2抑制劑可改善心血管臨床結局及減低死亡率[4],而格列美脲等降糖藥物卻無此功能。SGLT2抑制劑具有增加糖尿病 AS斑塊穩定性[5],降低系統或斑塊炎癥,減少腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活及氧化應激,改善內皮功能等作用[6],這一系列功能提示SGLT2抑制劑具有抗AS效應。另一方面,SGLT2抑制劑恩格列凈能降低心肌細胞NHE1 80%活性[7];SGLT2抑制劑能減輕NHE1野生型小鼠心肌細胞凋亡而抗心衰,而在 NHE1敲除小鼠中SGLT2抑制劑效應消失[8]。綜上,NHE1促進AS斑塊形成,SGLT2抑制劑具有抗 AS效應并能抑制NHE1活性,推測SGLT2抑制劑可能通過抑制NHE1活性而抗AS,但類似報道鮮見。本研究采用ApoE-/-小鼠為研究對象,高脂飲食喂養,制作動脈粥樣硬化炎癥模型[9],擬觀察SGLT2抑制劑達格列凈對高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠AS斑塊形成及RAW264.7巨噬細胞的影響,進而探討是否與NHE1的相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性6周齡ApoE-/-小鼠24只,基因背景為C57BL/6小鼠,小鼠體重均為(20±2)g,購自北京維通利華公司[SCXK(京)2019-0010],飼養于貴州醫科大學動物實驗室[SYXK(黔)2018-0001],動物實驗通過貴州醫科大學動物福利倫理委員會批準(2101044)。實驗研究過程中遵循替代、減少、優化的3R原則。

1.1.2 細胞

小鼠單核細胞細胞系RAW264.7細胞購自中國醫學科學院基礎所細胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗小鼠NHE1抗體(英國Abcam公司,ab230449);兔抗小鼠SGLT2抗體(英國Abcam公司,ab37296);GAPDH 抗體(美國GeneTex公司,GTX100118);HRP標記的山羊抗兔二抗(英國abcam公司,ab6721);ECL化學發光試劑盒(德國默克Millipore公司,1925901);胎牛血清(美國GIBCO公司,B5M54371);EDTA緩沖液(武漢塞維爾,G1206);胰酶(以色列BI公司,1552692);青鏈霉素混合液(以色列BI公司,1823547);DMEM培養基(美國GIBCO公司,8120425);達格列凈(美國Selleck公司,S154806);格列美脲(美國Selleck公司,S134401);阿米洛利(美國MCE公司,2016-88-8);尼日利亞菌素(nigericin)(美國Selleck公司,S665302);SNARF-1/AM(美 國Selleck公 司,S897401);高脂飼料(北京 博愛港公司,1145NA);ELISA試劑盒均由北京四正柏公司提供:TNF-α(20210930)、IL-1β(20211024)、IL-6(2021116)、IL-10(20211123)。TD-4279A血糖測試儀及血糖試紙(杭州 秦博科技);RM2016病理切片機(上海 徠卡儀器有限公司);Nikon Eclipse CI正置光學顯微鏡(日本 尼康);激光共聚焦顯微鏡(日本 Olympus 公司);實時熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物喂養、分組及觀察

SPF級雄性6周齡ApoE-/-小鼠24只,給予喂養普通飼料適應性喂養1周。1周后,隨機分為普通飲食組(ordinary diet group)、高脂飲食組(high-fat diet group)、達格列凈組(high-fat diet+dapagliflozin group)、格 列 美 脲 組(high-fat diet+glimepiride group),每組6只。普通飲食組予以普通飼料飼養,其余各組均高脂飼料(配方:1%膽固醇,0.2%膽酸鈉,10%豬油,10%蛋黃粉,78.8%基礎飼料)喂養,同時達格列凈組予以10 mg/(kg·d)生理鹽水溶解灌胃,格列美脲組予以0.5 mg/(kg·d)生理鹽水溶解灌胃,普通飲食組及高脂飲食組分別等量生理鹽水灌胃。高脂飼料陰涼干燥避光保存,每天每只5 g投食。飼養室環境通風良好,溫度(24±2)℃,相對濕度(50±10)%,12 h/12 h交替照明和避光。自由飲水,不同喂養及藥物干預后,禁食8 h尾靜脈取血檢測空腹血糖,連續喂養8周后,戊巴比妥鈉(30 mg/kg)靜脈麻醉后處死,取小鼠主動脈、腎皮質按照后續實驗操作進行。

1.3.2 HE染色檢測主動脈斑塊

各組小鼠采用多聚甲醛從左心室灌流后,取出主動脈,4℃ PBS中清洗3次,4%多聚甲醛固定,制備石蠟切片,HE染色,利用光學顯微鏡進行觀察并拍照,進行圖片數據分析,計算校正斑塊面積(斑塊面積/血管截面積)%。

1.3.3 免疫組化檢測斑塊 NHE1

各組病理切片在1 mmol/L EDTA緩沖液(pH=9.0)高壓修復3 min(氣壓閥冒大氣開始計時),抗原修復石蠟切片完成后,3% BSA室溫封閉30 min,加入3% BSA配制的NHE1一抗(1∶500),4℃孵育過夜,PBS清洗后,加入二抗,室溫孵育50 min,DAB顯色,蘇木精復染,脫水封片,觀察并拍照,用圖像分析軟件Image J Pro Plus 6.0進行分析。

1.3.4 定量PCR檢測各組SGLT2 mRNA表達

以高表達SGLT2的正常小鼠腎皮質為陽性對照(n=6),根據說明提取各組主動脈總RNA,按照逆轉錄及PCR試劑盒操作,分別取每組2 μg總RNA反轉錄合成cDNA,按照10 μL反應體系進行擴增,反應條件:95℃ 30 s,95℃ 15 min,60℃ 30 s,后兩步40個循環。引物設計:小鼠SGLT2基因mRNA(NM-133254.5)及GAPDH基 因(NM-008084.3)為模板自行設計引物,SGLT2基因:正向5’-CATTGGTGTTGGCTTGTGGT-3’,反向5’-CGAGACAATGGTAAGCCCCA-3’;GAPDH基因:正向5’-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3’,反 向5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’,上海生工公司合成。所有樣本的Ct 值均由熒光定量PCR 儀讀取,得到樣本中各基因的Ct 值。采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.3.5 免疫印跡法檢測SGLT2表達

為了顯示各組SGLT2表達情況,以高表達SGLT2的正常小鼠腎皮質組織作為陽性對照(n=6),稱取適量腎皮質、高脂飲食組、高脂飲食+達格列凈組及高脂飲食+格列美脲組主動脈組織,選擇從左心室發出后向下延伸約2 cm的主動脈,選擇的腎皮質大約與此相同重量。液氮搗碎,提取蛋白質,以蛋白濃度5～10 μg/μL為標準,以每組總蛋白質量30 μg計算出各組上樣體積,經SDS-PAGE電泳,濕法轉膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h,一抗(SGLT2 1∶1000)孵育4℃過夜,二抗室溫封閉2 h,ECL顯色,圖像分析軟件Image J進行灰度值分析。

1.3.6 細胞培養、分組及處理

RAW264.7 細胞培養于含高糖DMEM培養基(Hyclone),將培養瓶內生長至約80%的細胞胰酶消化離心,細胞沉淀濃重懸成每毫升1.5×105個的細胞懸液,每孔2 mL細胞懸液加入6孔板中,待細胞生長至匯合率＞80%,給予達格列凈(終濃度:10 μmol/L)、阿米洛利(終濃度:20 μmol/L)以及脂多糖(LPS,終濃度:100 ng/mL)分別或同時干預24 h,分為空白對照組(Blank control group)、脂多糖組(LPS group)、脂 多 糖+達 格 列 凈 組(LPS+dapagliflozin group)、脂多糖+阿米洛利組(LPS+amiloride group)、脂多糖+達格列凈+阿米洛利組(LPS+dapagliflozin+amiloride group),共5組。

1.3.7 檢測各組細胞 NHE1 的表達情況

不同藥物干預六孔板內細胞24 h后,提取蛋白,NHE1一抗稀釋比例(1∶1000),其余方法同動物部分Western blot操作。

1.3.8 檢測 pH 值回復率(NHE1活性)

采用熒光比率法檢測細胞內pH[10],將生長有融合度約80%的RAW264.7細胞的蓋玻片加入SNARF-1/AM溶液,37℃孵育30 min,洗滌后,激光共聚焦顯微鏡下,以激發波長為530 nm,檢測發射波長為580 nm和630 nm熒光強度,計算其比率。采取NH4Cl酸負荷法檢測細胞內pH值回復率(NHE1活性),采用30 mmol/L NH4Cl溶液浸浴3 min,無鈉溶液漂洗5 min 維持細胞內短暫酸中毒,繼而加或不加達格列凈或阿米洛利的含鈉溶液漂洗使Na+/H+交換加速,即促進NHE1活性增加。不同pH 高鉀溶液、SNARF-1/AM負載及nigericin孵育30 min,以pH值和熒光強度比細制作胞內pH標準曲線。

1.3.9 檢測各組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達

酶聯免疫吸附法檢測各組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達,收集各組細胞培養上清,依據ELISA試劑盒操作說明,測定各組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的分泌,自動酶標儀在 450 nm處讀取數值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料用平均數±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,兩組間差異比較方差齊時采用LSD法,方差不齊時采用T2檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 達格列凈減少非糖尿病AS形成

為排除血糖降低對AS形成的影響,以高脂飲食+格列美脲為對照,檢測高脂飲食+達格列凈干預對高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠AS形成的影響。結果提示(圖1A、1B)與普通飲食組相比,高脂飲食組斑塊顯著增加(P＜0.05);高脂飲食+達格列凈組AS斑塊面積低于高脂飲食組及高脂飲食+格列美脲組,且差異有統計學意義(P＜0.05),而高脂飲食+格列美脲組較高脂飲食組差異無統計學意義(P＞0.05)。此外,喂養過程中,藥物處理后監測血糖(如表1所示),高脂飲食組血糖較普通飲食組升高,但差異無明顯統計學意義(P＞0.05),高脂飲食+達格列凈組、高脂飲食+格列美脲組與高脂飲食組相比均可輕微減低血糖趨勢,但差異無統計學意義(P＞0.05)。提示相對于高脂飲食+格列美脲組,高脂飲食+達格列凈抑制斑塊形成,還是血糖觀察結果均提示達格列凈減少非糖尿病AS形成。

表1 6各組小鼠血糖變化情況(±s,mmol/L,n=6)Table 1 Changes in blood glucose of mice in each group

表1 6各組小鼠血糖變化情況(±s,mmol/L,n=6)Table 1 Changes in blood glucose of mice in each group

組別Groups 0周0 weeks 2周2 weeks 4周4 weeks 6周6 weeks 8周8 weeks普通飲食組Ordinary diet group 5.28±0.97 5.08±1.01 4.97±0.80 5.15±0.99 5.17±0.91 高脂飲食組High-fat diet group 5.33±0.60 5.10±0.88 5.28±0.71 5.35±0.63 5.30±0.86高脂飲食+達格列凈組High-fat diet+dapagliflozin group 5.13±0.46 4.92±0.56 4.60±0.98 4.62±0.94 4.82±0.63 高脂飲食+格列美脲組High-fat diet+glimepiride group 5.34±0.41 4.85±0.83 4.88±0.99 4.45±0.92 4.63±1.06 F 0.40 0.13 0.62 1.41 0.61 P 0.95 0.94 0.62 0.27 0.62

2.2 AS斑塊SGLT2蛋白及mRNA極低表達

為明確SGLT2抑制劑是否影響AS斑塊SGLT2表達,采用普通飲食組腎皮質作為陽性對照,檢測SGLT2在主動脈斑塊的蛋白及mRNA表達。結果顯示,與腎皮質陽性對照組比較,高脂飲食組、高脂飲食+達格列凈組、高脂飲食+格列美脲組主動脈斑塊中SGLT2蛋白及mRNA表達均非常低(P＜0.05)(圖2A～2C),且高脂飲食組、高脂飲食+達格列凈組、高脂飲食+格列美脲組3組間SGLT2蛋白及mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)。提示主動脈AS內極低表達SGLT2,且SGLT2抑制劑達格列凈亦未影響SGLT2表達,SGLT2抑制劑可能并非通過SGLT2靶點抗AS作用。

注:A:主動脈HE染色;B:主動脈的斑塊面積分析。1:普通飲食組;2:高脂飲食組;3:高脂飲食+達格列凈組;4:高脂飲食+格列美脲組。與普通飲食組相比, aP＜0.05;與高脂飲食組和高脂飲食+格列美脲組相比, bP＜0.05。圖1 達格列凈對ApoE-/-小鼠主動脈中動脈粥樣硬化斑塊的影響(n=6)Note.A, HE staining of aorta.B, Plaque area analysis of the aorta.1, Ordinary diet group.2, High-fat diet group.3, High-fat diet+dapagliflozin group.4, High-fat diet+glimepiridegroup group.Compared with ordinary diet group, aP＜0.05.Compared with high-fat diet group and high-fat diet+glimepiridegroup group, bP＜0.05.Figure 1 Effect of dapagliflozin on atherosclerotic plaques in the aorta of ApoE-/- mice

2.3 達格列凈抑制AS斑塊NHE1蛋白表達

因NHE1可促進AS斑塊形成,檢測 SGLT2 抑制劑達格列凈是否改變AS斑塊NHE1表達,結果顯示,與普通飲食組相比,高脂飲食組斑塊中NHE1表達有上升趨勢,但無統計學意義(P＜0.05)。而在高脂飲食喂養基礎上,SGLT2抑制劑達格列凈處理后斑塊內NHE1相對于高脂飲食組表達下調(P＜0.05),降糖藥格列美脲組斑塊內NHE1雖較高脂飲食組有所下降,但差異無統計學意義(圖3A、3B)。提示NHE1蛋白表達減低可能在SGLT2抑制劑達格列凈抗AS中發揮作用。

2.4 達格列凈抑制RAW264.7細胞 NHE1蛋白表達及活性

2.4.1 RAW264.7細胞 NHE1蛋白表達

為驗證動物實驗結果,以脂多糖誘導NHE1蛋白表達,給予SGLT2抑制劑達格列凈或 NHE1抑制劑阿米洛利干預,檢測RAW264.7細胞NHE1表達。結果如圖4A、4B顯示,與空白對照組相比,脂多糖組的NHE1蛋白水平上調(P＜0.05),而達格列凈以及阿米洛利均可逆轉脂多糖誘導的NHE1蛋白水平升高(P＜0.05),然而,阿米洛利+達格列凈聯合干預下,與阿米洛利或達格列凈單獨干預相比,NHE1蛋白水平無明顯變化(P＞0.05)。提示達格列凈或許通過NHE1受體作用,進而影響NHE1蛋白水平。

2.4.2 RAW264.7細胞 NHE1活性

NHE1功能方面,使用SNARF-1/AM雙熒光強度比率法檢測SGLT2抑制劑達格列凈對 RAW264.7細胞靜息pH值,結果顯示相對于對照組,在達格列凈、阿米洛利單獨或同時存在下,細胞靜息狀態下pH值降低,而3組靜息pH值差異無統計學意義(圖5A)。進而檢測NH4Cl脈沖酸負荷后pH回復率即NHE1活性,結果顯示與空白對照組相比,在達格列凈、阿米洛利單獨或同時存在下,細胞內NHE1活性均降低(P＜0.05);與達格列凈組相比,細胞內NHE1活性無明顯變化(P＞0.05)(圖5B)。達格列凈干預,細胞內pH值及細胞內NHE1活性變化效應與達格列凈與阿米洛利同時處理時效應相同,提示達格列凈可能通過抑制NHE1活性改變細胞內pH值。

注:A:免疫印跡法檢測主動脈SGLT2蛋白表達量;B:主動脈SGLT2蛋白表達量分析;C:qPCR檢測主動脈SGLT2 mRNA表達量。1:普通飲食組;2:高脂飲食組;3:高脂飲食+達格列凈組;4:高脂飲食+格列美脲組。與普通飲食組相比, aP＜0.05。圖2 主動脈組織中 SGLT2 表達情況(n=6)Note.A, Western blot detection of aortic SGLT2 protein expression.B, Analysis of aortic SGLT2 protein expression.C, qPCR detection of aortic SGLT2 mRNA expression.1, Ordinary diet group.2, High-fat diet group.3, High-fat diet+dapagliflozin group.4, High-fat diet+glimepiridegroup group.Compared with ordinary diet group, aP＜ 0.05.Figure 2 SGLT2 expression in aortic tissue

2.5 達格列凈抑制 RAW264.7細胞中炎性情況

與空白對照組比,LPS組細胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著增加(P＜0.05),IL-10含量顯著減少(P＜0.05);與LPS組比,LPS+達格列凈組及LPS+阿米洛利組可下調脂多糖誘導TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P＜0.05),上調IL-10含量(P＜0.05);與LPS+阿米洛利組比較,LPS+阿米洛利+達格列凈組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10含量無統計學差異(P＞0.05)(表2)。結果提示達格列凈可能通過NHE1途徑抑制LPS誘導炎癥效應。

表2 各組細胞上清TNF-α、IL-1β、IL-6與IL-10含量比較(±s,pg/mL,n=3)Table 2 Comparison of the contents of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in the supernatant of cells in each group

表2 各組細胞上清TNF-α、IL-1β、IL-6與IL-10含量比較(±s,pg/mL,n=3)Table 2 Comparison of the contents of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 in the supernatant of cells in each group

注:與空白對照組比較, aP＜0.05;與LPS組比較, bP＜0.05Note.Compared with Blank control group, aP＜0.05.Compared with LPS group, bP＜0.05.

組別Groups TNF-α IL-1β IL-6 IL-10空白對照組Blank control group 491.8±33.57 71.58±6.16 1458±43.52 578.6±56.99 LPS組LPS group 1010±61.63a 151.6±7.39a 2943±59.27a 253.1±51.71a LPS+達格列凈LPS+dapagliflozin group 597.6±43.06b 123.9±4.09b 1458±119.46b 424.3±43.22b LPS+阿米洛利組LPS+amiloride group 575.8±39.31b 119.3±9.16b 1576±39.31b 425.7±63.96b LPS+阿米洛利+達格列凈組LPS +amiloride+dapagliflozin group 545.7±23.44b 123.9±6.82b 1466±89.28b 395.6±42.06b F 73.29 52.42 218.5 14.71 P＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001 0.0003

注:A:免疫組化檢測主動脈斑塊中NHE1表達量;B:主動脈斑塊中NHE1表達量分析。1:普通飲食組;2:高脂飲食組;3:達格列凈組;4:格列美脲組。與高脂飲食組相比, aP＜0.05。圖3 達格列凈對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊組織中NHE1表達的影響(n=6)Note.A, Immunohistochemical detection of NHE1 expression in aortic plaques.B, Analysis of NHE1 expression in aortic plaques.1, Ordinary diet group.2, High-fat diet group.3, Dapagliflozin group.4, Glimepiride group.Compared with high-fat diet group, aP＜0.05.Figure 3 Effect of dapagliflozin on NHE1 expression in aortic plaque tissue of ApoE-/- mice

注:A:免疫印跡法檢測RAW264.7細胞中NHE1表達量的變化;B:RAW264.7細胞中 NHE1表達量分析。1:空白對照組;2:LPS組;3:LPS +達格列凈組;4:LPS+阿米洛利組,5:LPS+達格列凈+阿米洛利組。與空白對照組相比,aP＜0.05;與LPS組比較,bP＜0.05。圖4 達格列凈對RAW264.7細胞NHE1蛋白表達的影響(n=3)Note.A, Western blot was used to detect the changes of NHE1 expression in RAW264.7 cells.B, Analysis of NHE1 expression in RAW264.7 cells.1, Blank control group.2, LPS group.3, LPS+dapagliflozin group.4, LPS+amiloride group.5, LPS+dapagliflozin+amiloride group.Compared with Blank control group, aP＜0.05.Compared with LPS group, bP＜0.05.Figure 4 Effects of dapagliflozin on NHE1 protein expression in RAW264.7

注:A:SNARF-1/AM熒光法檢測RAW264.7細胞中pH變化分析;B:RAW264.7細胞中NHE1活性變化分析。1:空白對照組;2:達格列凈組;3:阿米洛利組;4:達格列凈+阿米洛利組。與空白對照組比較, aP＜0.05。圖5 達格列凈對 RAW264.7細胞NHE1活性的影響(n=3)Note.A, Analysis of pH changes in RAW264.7 cells detected by SNARF-1/AM fluorescence method.B, Analysis of changes in NHE1 activity in RAW264.7 cells.1, Blank control group.2, Dapagliflozin group.3, Amiloride group.4, Dapagliflozin+amiloride group.Compared with Blank control group, aP＜0.05.Figure 5 Effect of dapagliflozin on NHE1 activity in RAW264.7 cells

3 討論

AS斑塊形成以脂代謝異常、動脈壁炎癥為重要特征的病理過程。SGLT2抑制劑是目前唯一被臨床試驗證實具有降低心血管疾病風險的降糖藥。本研究結果顯示SGLT2抑制劑達格列凈可減少ApoE-/-小鼠AS斑塊形成,進而表明SGLT2抑制劑達格列凈不僅可抑制斑塊NHE1表達,還可抑制細胞NHE1活性以及LPS誘導炎癥因子釋放,這些作用亦可被NHE1抑制劑阿米洛利所拮抗,提示抑制NHE1表達及活性,或許是SGLT2抑制劑抗AS的新機制。

3.1 達格列凈減少非糖尿病AS形成

SGLT2抑制劑是一種通過阻斷腎近端小管中的SGLT2來達到抑制腎葡萄糖重吸收的新型降糖藥。SGLT2抑制劑具有心血管的保護作用,可以降低血糖、改善心臟功能。此外,SGLT2 抑制劑還可抑制抗炎因子表達、改善免疫細胞表型以及機體酮體代謝等[11]。研究表明SGLT2抑制劑能減少糖尿病小鼠AS斑塊形成[12-13],從而減弱AS的發生發展。本研究發現在ApoE-/-敲除小鼠中普通飲食喂養仍有少量斑塊形成,而高脂飲食喂養會使斑塊生長明顯,且高脂飲食組的斑塊增加可被SGLT2抑制劑達格列凈抑制,非SGLT2抑制劑降糖藥格列美脲組AS斑塊卻無明顯減少,提示達格列凈可減少非糖尿病ApoE-/-小鼠AS斑塊形成,降糖藥格列美脲無抗AS效應。本研究采用經典ApoE-/-小鼠制作動脈粥樣硬化模型,使用高脂飲食喂養可使其模型成功率高,而普通飲食組造成典型AS模型所需時間更長,在本研究時間范圍內難以成功,故本研究采用了普通飲食組做空白對照,高脂飲食喂養制作模型。此研究還發現各組小鼠血糖在達格列凈及格列美脲不同降糖藥物處理下,相對于高脂飲食組,小鼠血糖雖有下降趨勢,但無明顯統計學差異,可能有以下原因:(1)可能實驗動物系非糖尿病模型;(2)檢測血糖時采用的尾部靜脈血較少;(3)測量血糖方法不精確;(4)實驗小鼠樣本量少,故本實驗并不排除達格列凈通過影響小鼠血糖進而對斑塊的影響。有趣的是,兩種降糖藥均未明顯降低小鼠正常血糖,本研究再次重現既往降糖藥SGLT2抑制劑抑制非糖尿病小鼠AS斑塊形成的結果[14-16],這意味著有必要深入探討SGLT2抑制劑減少AS形成的新機制,為選擇SGLT2抑制劑治療AS相關疾病提高新的研究策略[11]。

3.2 AS斑塊SGLT2蛋白及mRNA極低表達

SGLT2抑制劑在體內從兩方面發揮作用:(1)主要通過腎小管上皮細胞SGLT2靶向作用;(2)脫靶效應[17]。因本實驗研究高脂飲食誘導AS模型情況下,主動脈內SGLT2的表達情況,故本研究僅列出了高脂飲食喂養情況下主動脈內SGLT2的表達情況,未羅列出普通飲食組斑塊內的SGLT2表達情況,同高脂飲食組呈相同水平。本研究發現高脂飲食喂養下,與腎皮質高表達 NHE1 mRNA及蛋白質相比,小鼠主動脈斑塊SGLT2蛋白和 mRNA表達非常低;無論是否達格列凈干預,動脈斑塊 SGLT2表達無明顯改變,提示 SGLT2高度特異性表達于腎小管[18],SGLT2可能對斑塊發生發展作用有限,而SGLT2抑制劑的脫靶效應可能發揮重要作用。研究發現SGLT2 抑制劑恩格列凈通過脫靶效應降低心肌細胞NHE1活性,抑制心肌細胞凋亡[7-8]。

3.3 達格列凈抑制NHE1蛋白表達

本研究在AS斑塊及巨噬細胞上探討了SGLT2抑制劑是否具有抑制NHE1的脫靶效應。我們發現高脂飲食組相較普通飲食組斑塊內NHE1表達增加,且高脂飲食組內增加的 NHE1可被SGLT2抑制劑達格列凈藥物所抑制,而格列美脲無此生理效應。達格列凈可抑制斑塊內NHE1表達。

本文從動物體內實驗中探究了達格列凈對NHE1的抑制作用,選擇RAW巨噬細胞 LPS誘導體外炎癥模型,探究達格列凈對體外細胞炎癥模型下NHE1的作用,發現達格列凈可降低細胞內pH以及抑制NHE1活性,且這些作用亦可被NHE1抑制劑阿米洛利所拮抗,提示SGLT2抑制劑能通過脫靶效應抑制 NHE1活性。NHE1廣泛分布于各種細胞的細胞膜[19]。

3.4 達格列凈抑制 RAW264.7細胞中炎性情況

本研究通過檢測各組藥物作用后培養細胞中的炎癥因子的變化,發現LPS誘導的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的增加以及抗炎因子IL-10的減少炎癥因子釋放可被達格列凈逆轉。且達格列凈的逆轉效應與NHE1抑制劑單獨或共同處理時效應相接近,提示達格列凈的抗炎效應可能通過抑制NHE1產生。

NHE1 將胞外Na+及胞內H+進行交換,主要參與調節細胞內pH值。本研究以及我們之前研究均表明AS斑塊中NHE1表達增高[19],斑塊炎癥細胞浸潤部位pH值降低。炎癥或缺血區域常會出現 pH值呈酸性,酸性環境又導致斑塊環境內的巨噬細胞功能異常,促進AS斑塊形成[20]。即提示酸性環境與斑塊發生發展可相互促進。新進有研究Floralozone能通過抑制NHE1抗AS[21],亦提示了NHE1在AS中的關鍵作用。雖然本研究未檢測達格列凈干預后斑塊內pH,但我們研究表明SGLT2抑制劑可通過抑制NHE1活性抑制AS斑塊形成,將達格列凈的抗AS效應與NHE1聯系起來,縮短NHE1基礎研究的臨床轉化。

AS斑塊中巨噬細胞及平滑肌細胞是泡沫細胞的兩個主要來源,而本研究在斑塊組織中未能區別何種細胞NHE1表達。鑒于單核巨噬細胞是AS斑塊主要組成細胞,故以巨噬細胞作為研究對象,發現達格列凈抑制細胞 NHE1蛋白表達及NHE1活性,抑制LPS誘導炎性因子的釋放,且這種抑制效應并未被NHE1抑制劑阿米洛利增強。我們的研究結果與 SGLT2抑制劑能通過抑制巨噬細胞向M1細胞分化而抑制炎癥因子釋放一致[13],同時 NHE1也參與M1細胞分化[22],提示SGLT2抑制劑可能通過抑制NHE1表達及活性發揮抗炎作用。

3.5 研究的不足及結論

本研究尚未對斑塊酸化程度進行研究,未對SGLT2抑制劑作用于NHE1基因敲除小鼠探究其抗AS機制,本課題組將在后續的研究中進行完善。

總之,盡管本研究未能在機制上深入研究,但結果表明SGLT2抑制劑可能通過抑制 NHE1表達及活性而發揮抗AS作用。這些發現或許會深化SGLT2抑制劑心血管保護作用的認識,拓展SGLT2抑制劑臨床運用,為探討NHE1參與AS斑塊形成的機制研究和臨床轉化提供新思路。